Axis Homocysteine EIA - FHCY100
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Instructions for use
Mode d’emploi
Gebrauchsanweisung
Istruzioni per l’uso
Instrucciones de uso
Instruções da utilização
Bruksanvisningen
Brugervejledning
Axis® Homocysteine EIA
FHCY100
Axis-Shield Diagnostics Ltd.
The Technology Park
Dundee DD2 1XA
United Kingdom
Tel: +44 (0) 1382 422000
Fax: +44 (0) 1382 422088English EN 5 – 14
Français FR 15 - 24
Deutsch DE 25 – 34
Italiano IT 35 – 44
Español ES 45 – 54
Portuguese PT 55 – 64
Svensk SE 65 – 67
Dansk DK 68 - 70
2Product code / Numéro de produit / Artikkelnummer / Codice Prodotto
/ Número de lista / Número de lista / Artikelnumret / Produktnummer
For in-vitro diagnostic use / Pour usage diagnostique in-vitro / Nur zur
In-vitro-Diagnose verwenden / Per uso dignostico in- vitro / Para
diagnóstico in-vitro / Para diagnóstico in-vitro / För in-vitro-diagnostisk
användning / Til in-vitro-diagnostisk brug
Lot number / Numéro de lot / Chargenummer / Numero lotto / Número
de lote / Número do lote / Lotnummer / Partinummer
Consult instructions for use / Consultar le mode d’emploi /
Gebrauchsanweisung beachten / Leggere le istruzioni per l’uso /
Consulte las instrucciones de uso / Consultar instruções da utilização /
Se bruksanvisningen / Se brukervejledning
Expiration date / Date de péremption / Verfallsdatum / Data di
scadenza / Fecha de caducidad / Data de validade / Utgångsdatum /
Udløpsdato
Store at 2-8 °C / Stocker entre 2 et 8 °C / Lagerung bei 2-8°C /
Concervare a 2-8 °C / Manténgase de 2-8 °C / Conservar entre 2-8 °C /
Förvaras vid 2-8 °C / Opbevares ved 2-8 °C
CAUTION! Handle human sourced materials as potentially infectious.
Consult instructions for use (Infection Risk) / ATTENTION! Manipuler les
produits d’origine humaine comme des produits potentiellement
infectieux. Consulter le mode d’emploi (risque d’infection) / ACHTUNG!
Aus Humanmaterial gewonnene Stoffe immer als potenziell infektiös
behandeln. Gebrauchsanweisung beachten (Infektionsgefahr) /
ATTENZIONE! Maneggiare i materiali di origine umana come
potenzialmente infetti. Lggere le istruzioni per l'uso (Rischio di
infezione) / PRECAUCIÓN: Maneje los materiales de origen humano
como potencialmente infecciosos. Consulte las instrucciones de uso
(riesgo de infección) / CUIDADO! Trate os materiais de origem humana
como potencialmente infecciosos. Consulte as instruções de utilização
(Risco de Infecção) / VARNING! Hantera material med mänskligt
ursprung som eventuell smittofara. Se bruksanvisningen
(Infektionsrisk) / FORSIGTIG! Materiale fra humane kilder skal
håndteres som potentielle smittekilder. Se brugervejledningen
(infektionsrisiko)
Control Kit / Kit de contrôles / Kontroll Kit / Kit di controlli /
Kit de control / Kit de controlo / Kontrollkit / Kontrol kit
Calibrator Kit / Kit d’étalons / Kalibrator Kit / Kit de calibratori / Kit de
calibrador / Kit de calibração / Kalibratorkit / Kalibrator kit
96 tests / 96 testes / 96 Tests / 96 test / 96 ensayos / 96 testes / 96
tester / 96 prøver
Reagent A-S / Réactifs A à S / Reagens A-S / Reagenti A-S / Reactivo A-
S / Reagente A-S / Reagens A-S / Reagens A-S
Wash Buffer / Tampon de lavage / Waschpuffer / Tampone di lavaggio
/ Tampón de Lavado / Solução tamponada de lavagem / Tvättbuffert /
Vaskebuffer
Calibrator 1-6 / Etalons 1 à 6 / Kalibrator 1-6 / Calibratori 1-6 /
Calibrador 1-6 / Calibrador 1-6 / Kalibrator 1-6 / Kalibrator 1-6
3Control low, medium, high (L, M, H) / Contrôle bas, moyen, haut (L, M,
H) / Kontrolle: niedrig, mittel, hoch (L, M, H) / Controllo basso, medio,
alto (L, M, H) / Control bajo, medio, alto (L, M, H) / Controlo baixo,
médio, alto (L, M, H) / Kontroll låg, medel, hög (L, M, H) / Kontrol lav,
medium, høj (L, M, H)
Microtitre Strips / Barrettes de microtitrage / Mikrotiter-streifen /
Strisce di Microtitolazione / Tiras Microtiter / Tiras de micro-titulação /
Mikrotiter-remsor / Mikrotiter-strips
For Prescription Use Only / Sur prescription médicale uniquement /
Verschreibungspflichtig / Uso solo dietro prescrizione medica / Solo con
Rx Only receta médica / Apenas para utilização mediante receita médica /
Används endast vid förskrivning / Verschreibungspflichtig
4Contents
Intended Use 5
Summary and Explanation of the Test 5
Assay Principle 6
Warnings and Precautions 7
Kit Components 7
Preparation and Storage of Kit Components 8
Specimen Collection and Preparation 9
Limitations 9
Procedure 9
Interpretation of Results 11
Quality Control 11
Reference Range 11
Measuring Range 11
Performance Data 12
Product Safety Information 14
References 70
Intended Use
The Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (EIA) is intended for the quantitative determination
of total L-homocysteine in human serum or plasma. The device can assist in the diagnosis and treat-
ment of patients suspected of having hyperhomocysteinemia and homocystinuria.
Summary and Explanation of the Test
Homocysteine (Hcy) is a thiol-containing amino acid produced by the intracellular demethylation of
methionine. Hcy is exported into plasma where it circulates mostly in its oxidized forms bound to
plasma proteins.1, 2 ,3, 4 Smaller amounts of reduced homocysteine and disulfide homocystin (Hcy-SS-
Hcy) are present. Total homocysteine represents the sum of all Hcy species found in plasma and
serum (free plus protein-bound).
Hcy is either metabolised to cysteine or to methionine. In the vitamin B6 dependent
transsulphuration pathway Hcy is irreversibly catabolised to cysteine. A major part of Hcy is
remethylated to methionine, mainly by the folate and cobalamin- dependent enzyme methionine
synthase. Hcy accumulates and is excreted into the blood when these reactions are impaired.2,4
Severely elevated concentrations of Hcy are found in subjects with homocystinuria, a rare genetic
disorder of the enzymes involved in the metabolism of Hcy. Patients with homocystinuria exhibit
mental retardation, early arteriosclerosis and arterial and venous thromboembolism.1, 5 Hcy
reducing therapy improves the prognosis for this disease.5 Other less severe genetic defects which
lead to moderately elevated levels of Hcy are also found.6, 7,8
Epidemiological studies have investigated the relationship between Hcy levels in blood and -
cardiovascular disease (CVD). A meta analysis of 27 epidemiological studies, including more than
4000 patients, estimated that a 5 µmol/L increase in Hcy was associated with an odds ratio for
coronary artery disease (CAD) of 1.6 for men and 1.8 for women, or the same that is
5associated with 0.5 mmol/L (20 mg/dL) increase in cholesterol. Peripheral arterial disease also
showed a strong association.9
Certain patient groups with anemia and/or asthenia also demonstrate increased levels of plasma- or
serum Hcy. 10,11
Patients with chronic renal disease experience an excess morbidity and mortality due to
arteriosclerotic CVD. Elevated concentration of Hcy is a frequently observed finding in the blood of
these patients. Although such patients may lack some of the vitamins involved in the metabolism of
Hcy, the increased levels of Hcy are mainly due to impaired removal of Hcy from the blood by the -
kidney.12, 13
Drugs such as methotrexate, carbamazepine, phenytoin, nitrous oxide and penicillamine interfere
with the Hcy metabolism and may give elevated levels of Hcy.14, 15
Assay Principle
Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (EIA) is an enzyme immunoassay for the determination of
Hcy in blood.16 Protein-bound Hcy is reduced to free Hcy and enzymatically converted to
S-adenosyl-L-homocysteine (SAH) in a separate procedure prior to the immunoassay.17 The enzyme
is specific for the L-form of homocysteine, which is the only form present in the blood.
Reduction
Hcy, mixed disulfide and protein-bound forms of Hcy in the sample are reduced to free Hcy by use of
dithiothreitol (DTT).
Prot-SS-Hcy DTT
*R1-SS-Hcy HCY
Hcy-SS-Hcy
*R1 is any thiol-residue.
Enzymatic conversion
Hcy in the test sample is converted to S-adenosyl-L-homocysteine by the use of SAH hydrolase and
excess adenosine (Ad).
SAH-hydrolase
Hcy + Ad SAH + H2O
The following solid-phase enzyme immunoassay is based on competition between SAH in the sample
and immobilised SAH bound to the walls of the microtitre plate for binding sites on a monoclonal
anti-SAH antibody. After removal of unbound anti-SAH antibody, a secondary rabbit anti-mouse
antibody labelled with the enzyme horse radish peroxidase (HRP) is added. The peroxidase activity is
measured spectrophotometrically after addition of substrate, and the absorbance is inversely related
to the concentration of Hcy in the sample.
6Warnings and Precautions
1. For in-vitro Diagnostic Use Only.
2. Reagent D contains 0.15% merthiolate (< 0.074% mercury). Please handle and dispose of properly.
3. 0.01% merthiolate is used as preservative in some reagents. Each kit contains less than 0.028%
mercury. Please handle and dispose of appropriately.
4. Reagent F contains mouse antibodies and Reagent G contains rabbit antibodies.
5. Reagent S contains 0.8M sulphuric acid, and is classified as “Danger”. Please handle and dispose
of properly (See section “Product Safety Information”).
6. Calibrators, Controls, Reagent A and Reagent E contain less than 0.10% sodium azide as
preservative. Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive
metal azides. On disposal, flush with a large volume of water to prevent azide build-up.
7. Controls contain sera originating from human blood samples. The source materials
havebeen tested and found to be negative for Hepatitis B Surface Antigen (HBsAG), HIV-1 Antigen
(HIVAg), HCV antibody, HIV-1/2 antibody, HTLV-1/2 antibody and Hepatitis B core Antibody (HBc).
However, blood derivatives should be handled according to recommended procedures for
handling infectious material. HHS publication no. (CDC) 93-839518 or local/national guidelines on
laboratory safety procedures should be consulted.
8. Reagents with different lot numbers must not be interchanged.
9. Do not use the kit after the expiration date on the outer box.
Caution: Federal law restricts this device to sale by or on the order of a physician.
Kit Components
FHCY100 Axis® Homocysteine EIA Kit, 96 wells
Kit Components Solution Component Description Volume
Assay buffer Phosphate buffer, sodium azide 54mL
Adenosine/
Adenosine / dithiothreitol, citric acid 3.5mL
DTT
SAH- Recombinant S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase,
3.5mL
hydrolase trisbuffer, glycerol,methylparaben
Enzyme
Merthiolate, phosphate buffer 55mL
inhibitor
Adenosine Adenosine deaminase, phosphate buffer, sodium
55mL
deaminase azide, BSA, phenol-red dye
a-SAH Monoclonal mouse-anti-S-adenosyl-L-
25mL
antibody homocysteine antibody, BSA, merthiolate
Enzyme Rabbit anti-mouse-antibody enzyme conjugate, BSA,
15mL
conjugate horse radish peroxidase, blue dye
Substrate
N-methyl-2-pyrrolidon, propyleneglycol 15mL
solution
7Stop solution 0.8 M Sulphuric acid 20mL
Wash buffer Phosphate buffer, merthiolate, Tween 20, BSA 60mL
S-adenosyl-L-homocysteine 6x
Calibrators
(2, 4, 8, 15, 30, 50 µmol/L) in buffer with preservative 1.5mL
Microtitre 12 x 8
Coated with S-adenosyl-L-homocysteine
strips wells
is concentrated and must be diluted (1+9) with purified water before use.
All other components are ready to use.
FHCY200 Axis Homocysteine EIA Control Kit
Kit Components Component Description Volume
7.0 µmol/L homocysteine in diluted serum samples of human origin,
1.5mL
phosphate buffer and preservative
12.5 µmol/L homocysteine in diluted serum samples of human
1.5mL
origin, phosphate buffer and preservative
25.0 µmol/L homocysteine in diluted serum samples of human
1.5mL
origin, phosphate buffer and preservative
All controls are ready to use.
FHCY050 Axis® Homocysteine EIA Wash buffer
Kit Components Component Description Volume
Phosphate buffer, merthiolate, Tween 20, BSA 1000mL
is concentrated and must be diluted (1+9) with purified water before use.
Materials required but not provided in the kit:
Homocysteine controls (see section “Quality Controls” for more information)
Plastic or glass tubes for pre-treatment of samples
Pipettes / multipipettes 25 µL, 100 µL, 200 µL and 500 µL or 8 channel multipipette for 100 µL and
200 µL
Volumetric flask 50 mL and 600 mL
Incubator, 37 °C
Washer and reader (450 nm) for microtitre plates
Preparation and Storage of Kit Components
1. Components should be stored refrigerated (2 - 8 °C). Store all bottles upright and tightly capped.
The components are stable until the stated expiration date when stored and handled as directed.
Once the components in the Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (EIA) Kit are opened they
are stable for 12 weeks when stored at 2-8 °C.
2. The sample pre-treatment solution has to be made by mixing Reagent A, B and C (see Section
“Procedure”). The solution is stable for one hour and has to be freshly made for each run.
3. The Wash buffer must be diluted (1+9) with distilled water before use. The prepared Wash buffer
is stable for 4 weeks when stored at room temperature (18-25 °C).
84. Reagent D and H are stored in dark bottles to avoid exposure to light.
5. It is important that the microtitre strips are kept dry, i.e. in the sealed bag with drying capsules,
and stored refrigerated. Equilibration for a minimum of two hours is required to reach room
temperature (18 - 25 °C). Leave the strips in the bag during equilibration.
6. Only the necessary number of microtitre strips should be kept in the frame during the run. Unused
strips should be kept in the sealed bag with drying capsules.
7. Avoid exposure of the kit to temperatures exceeding 37 °C as this may denature the enzymes.
Specimen Collection and Preparation
EDTA-plasma or serum may be used with the Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (EIA) assay.
As synthesis of Hcy continues in red blood cells after drawing, it is very important to prepare specimens
as follows:
Serum samples should be allowed to clot for no more than 30 minutes before centrifugation and
separation of serum. Serum samples should be kept on ice prior to separation.
EDTA-plasma samples must be centrifuged or put on ice immediately after drawing. EDTA-plasma
samples may be kept on ice for up to 6 hours prior to separation by centrifugation.
Food consumption can affect circulating homocysteine levels. Protein rich meals give higher
homocysteine values and should be avoided late in the day before sampling.19, 20
Standardised sampling procedures are crucial due to the above mentioned influencing factors.
Complete mixing of thawed samples is required before use.
Plasma or serum samples may be stored for 12 weeks at 2 - 8 °C, for up to 3 weeks at room temperature
(18 - 25 °C) and have been shown to be stable for at least 8 months if frozen at minus 20 °C.
Limitations
If an automatic pipetting station is used, thorough washing of the tubing after addition of the blue
coloured Reagent G may be needed - preferably with diluted acid followed by water. Any
remaining solution in the tubing will interfere with the next assay step; i.e. addition of Reagent H.
The washing procedure is critical for obtaining good precision. If manual washing is required, use
4 times 350 µL instead of 3 times 400 µL. After washing, empty the wells on paper towels.
Avoid exposure of the kit to temperatures exceeding 37 °C as this may denature the enzymes.
Specimens from patients who are on drug therapy involving S-adenosyl-methionine may show
falsely elevated levels of homocysteine.
Specimens from patients who have received preparations of mouse monoclonal antibodies for
diagnosis or therapy may contain human anti-mouse antibody (HAMA). HAMA, present in serum
or plasma specimens, may interfere in immunoassays which utilise mouse monoclonal antibodies.
These specimens should not be assayed with the Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (EIA)
assay.
Specimens from patients taking methotrexate, carbamazepine, phenytoin, nitrous oxide, anti-
convulsants or 6-azauridine triacetate, may have elevated levels of homocysteine due to metabolic
interference with the homocysteine metabolism.
Procedure
Make sure all solutions and microtitre strips are equilibrated to room temperature before use. Leaving
the kit at room temperature over night is recommended. We recommend running the calibrators in
duplicate and to performing a new calibration curve for each run to avoid run-to-run variations using
coated microtitre plates.
9Sample pre-treatment procedure
1. Sample pre-treatment solution must be made up no more than 1 hour prior to the start of the
assay. Volume needed per 10 samples (no dead volume calculated):
4.5 mL
0.25 mL
0.25 mL Mix
2. Dilute calibrators and samples/controls in plastic or glass tubes as follows:
25 µL calibrator/sample/control
+ 500 µL sample pre-treatment solution
Mix well.
Incubate for 30 minutes at 37 °C (Cap the tubes or cover with parafilm during incubation).
Note: Proceed with step 3 before the samples have cooled.
3. Add 500 µL
Mix well.
Incubate for 15 minutes at 18-25 °C.
4. Add 500 µL
Mix well.
Incubate for 5 minutes at 18-25 °C.
Microtitre plate procedure
5. Pipette 25 µL diluted calibrator / sample / control from step 4 into the wells of the SAH-coated
microtitre strips.
6. Add 200 µL to each well.
Incubate for 30 min at 18-25 °C.
Use the enclosed lid during all incubations.
7. Wash with diluted Wash buffer ( + purified water).
Use 3 x 400 µL. If manual washing is required, use 4 times 350 µL instead of 3 times 400 µL. After
washing, empty the wells on paper towels.
8. Add 100 µL to each well.
Incubate for 20 min at 18-25 °C.
9. Wash with diluted Wash buffer ( + purified water).
Use 3 x 400 µL. If manual washing is required, use 4 times 350 µL instead of 3 times 400 µL. After
washing, empty the wells on paper towels.
10. Add 100 µL to each well.
Incubate for 10 min at 18-25 °C.
11. Add 100 µL to each well.
12. Shake and read at 450 nm within 15 minutes (Automatic plate shaker is preferred to ensure proper
mixing).
10Interpretation of Results
Results should be interpreted considering all other test results and the clinical status of the patient.
We recommend that a four parameter logistic curve fit is used for preparing the calibration curve and
calculation of unknown samples.
Quality Control
We recommend that each laboratory use a homocysteine control with known value.
Axis-Shield provides a set of low, medium and high controls, FHCY200.
The controls contain L-homocysteine in processed human serum at the following concentrations:
Control Mean Value Hcy Range HCY
(µmol/L) (µmol/L)
7.0 5.6 – 8.4
12.5 10.0 – 15.0
25.0 20.0 – 30.0
Reference Range
The reference range should be determined by each laboratory to confirm the characteristics of the
population being tested. As a point of reference, the following data may be used until the laboratory
has analysed a sufficient number of samples to determine its own reference range.
The Hcy concentration in plasma or serum of healthy individuals varies with age, gender, geographical
area and genetic factors. Scientific literature reports reference values for adult male and females
between 5 and 15 µmol/L, men having higher values than women, and post menopausal women
having higher homocysteine values than pre menopausal women.21, 22, 23 Hcy values will normally
increase with age, giving a reference range among an elderly population (> 60 years) of 5 - 20 µmol/L.24
In countries with folic acid fortification programmes, reduced levels of Hcy may be observed.25, 26
Samples from 382 males and females (100 Scandinavians; 54 males aged 30 - 60, 46 females aged
29- 70. 185 Hispanics; predominantly males aged 20 - 65. 97 Americans; 54 males aged 16 - 74, 43
females aged 15 - 79), apparently healthy, without information on current medications, disease states
or known risk conditions for elevated homocysteine, were tested using the Axis® Homocysteine
Enzyme Immunoassay (EIA). The median value of the homocysteine concentration among
Scandinavians was 8.4 µmol/L, among Hispanics 8.9 µmol/L and among Americans 9.3 µmol/L.
The homocysteine reference range was established based on 95% confidence limits as 5 - 15 µmol/L
for the Scandinavian population, 3.6 - 15.0 µmol/L for the American population and 2.9 - 16.0 µmol/L
for the Hispanic population.
Measuring Range
The calibrator range is from 2 to 50 µmol/L.
11Performance Data
Assay Precision
Precision of the Axis® Homocysteine EIA assay was evaluated according to NCCLS Protocol EP5-T2.
Three levels of controls were assayed for 20 days with 4 replicates per run at each level. Precision data
are summarised in Table 1.
Table 1: Precision
Samples Average HCY Within run Total Precision
µmol/L precision
Control Low 6.1 8% 10 %
Control Medium 10.5 7% 9%
Control High 20.6 8% 10 %
Limit of quantification
The quantification limit (CV < 20%) is 1.0 µmol/L.
Linearity of diluted plasma samples
If the homocysteine concentration of a sample exceeds the range of the calibration curve, the sample
should be diluted with Reagent A and reanalysed.
The linearity was evaluated by diluting four high patient samples with varying amounts of Reagent A
as diluent.
Linear regression analysis gave:
Slope: 0.98
Intercept: -0.4 µmol/L
Correlation coefficient r2: 0.99
Method Comparison
The Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (EIA) was compared to the University of Bergen HPLC
method.27
A comparison of 164 patient samples ranging from 3 - 37 µmol/L homocysteine gave the linear
regression shown in Figure 1.
12Figure 1: Method Comparison
Interfering Substances
Bilirubin, haemoglobin, lipids, red blood cells, protein and sodium fluoride were spiked into plasma
samples and tested for interference by Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (EIA).
The assay demonstrated less than 10% interference in the presence of:
bilirubin (0.5 g/L), haemoglobin (10 g/L), triglycerides (10 g/L), red blood cells (5.0% v/v), protein
(80 g/L) and sodium-fluoride (10 g/L).
Cross-reactivity
Cross-reactivity was tested for compounds that may interfere with the Axis® Homocysteine Enzyme
Immunoassay (EIA) assay. The assay demonstrated 16% cross-reactivity in the presence of S-adenosyl-
L-methionine (0.5 mmol/L) and less than 1% cross-reactivity in the presence of: Adenosine
(5.0 mmol/L), cystathionine (0.5 mmol/L), L-cysteine (100 mmol/L), glutathione (100 mmol/L) and
thiolactone (0.5 mmol/L).
13Product Safety Information
WARNING
H314 – Causes severe skin burns and eye damage.
DANGER PREVENTION
P264 – Wash hands thoroughly after handling.
P280 – Wear protective gloves / protective clothing / eye
protection / face protection.
RESPONSE
P303+361+353 – IF ON SKIN (or hair): Remove immediately all contaminated
clothing. Rinse skin with water/shower.
P305+351+338 – IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes.
Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue
rinsing.
P405 - Store locked up.
14Table des matières
Indication 15
Résumé et explication du test 15
Principe du test 16
Mises en garde et précautions 16
Composants de la trousse 17
Préparation et conservation des composants de la trousse 18
Recueil et préparation des échantillons 19
Limites 19
Procédure 20
Interprétation des résultats 21
Contrôles de qualité 21
Plage de référence 21
Plage de mesure 22
Caractéristiques de performance 22
Information relative à la sécurité du produit 24
Références 70
Indication
L'Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (EIA) est destiné à la détermination quantitative de la
L-homocystéine totale dans le sérum ou le plasma humains. Le dispositif peut aider au diagnostic et
au traitement de patients chez lesquels on soupçonne une hyperhomocystéinémie et une
homocystinurie.
Résumé et explication du test
L’homocystéine (Hcy) est un acide aminé contenant un groupement thiol, produit par la déméthylation
intracellulaire de la méthionine. L’homocystéine est exportée dans le plasma où elle circule
essentiellement sous forme oxydée, liée aux protéines du plasma.1, 2, 3, 4 Des quantités plus faibles
d'homocystéine réduite et de son bisulfure, l'homocystine (Hcy-SS-Hcy), sont présentes.
L'homocystéine totale représente la somme de toutes les espèces d'Hcy trouvées dans le plasma et le
sérum (libre plus liée aux protéines).
L’Hcy est métabolisée soit en cystéine, soit en méthionine. Dans la voie de trans-sulfuration
dépendante de la vitamine B6, l'Hcy est irréversiblement catabolisée en cystéine. Une partie
importante de l’Hcy est reméthylée en méthionine, principalement par la méthionine synthase, une
enzyme dépendante de l'acide folique et de la cobalamine. L’Hcy s'accumule dans les cellules et est
excrétée dans le sang lorsque ces réactions sont altérées.2, 4
Des concentrations très élevées d'Hcy se retrouvent chez les sujets atteints d’homocystinurie, un
trouble génétique rare des enzymes impliquées dans le métabolisme de l'Hcy. Les patients avec
homocystinurie présentent un retard mental, une artériosclérose précoce et une thromboembolie
artérielle et veineuse.1,5 Un traitement visant à réduire l'Hcy améliore le pronostic de cette maladie.5
On observe également d’autres anomalies génétiques moins sévères menant à des taux modérément
élevés d’homocystéine.6, 7, 8
15Des études épidémiologiques ont évalué la relation entre les taux sanguins d'Hcy et les maladies
cardiovasculaires. Une méta-analyse de 27 études épidémiologiques, portant sur plus de 4000
patients, a estimé qu’une augmentation de 5 µmol/l de l'Hcy était associée à une hausse de chance de
maladie coronaire de 1,6 pour les hommes et de 1,8 pour les femmes, une augmentation comparable
au risque associé à une augmentation de 0,5 mmol/l (20 mg/dl) du taux de cholestérol. Les maladies
artérielles périphériques présentaient également une association étroite.9
Certain groupes de patients souffrant d'anémie et/ou d'asthénie ont également présenté des taux
plasmatiques et sériques élevés d'Hcy.10, 11
Les patients avec insuffisance rénale chronique présentent un excédent de morbidité et de mortalité
dû à des maladies cardiovasculaires artérioscléreuses. Des concentrations élevées en Hcy s'observent
souvent dans le sang de ces patients. Bien qu’il puisse manquer à ces patients certaines des vitamines
impliquées dans le métabolisme de l’Hcy, les taux élevés d'Hcy sont principalement dus à une
mauvaise élimination de l’Hcy du sang par les reins.12, 13
Des médicaments tels que le méthotrexate, la carbamazépine, la phénytoïne, l'oxyde nitrique et les
pénicillamines interfèrent avec le métabolisme de l’Hcy et peuvent donner des taux élevés d'Hcy.14, 15
Principe du test
Axis® Homocysteine EIA est un test immuno-enzymatique pour le dosage de l’Hcy dans le sang.16 L’Hcy
liée aux protéines est réduite en Hcy libre et convertie enzymatiquement en S-adénosyl-L-
homocystéine (SAH) par une procédure distincte avant le test immuno-enzymatique.17 L’enzyme est
spécifique de la forme L de l’homocystéine, qui est la seule forme présente dans le sang.
Réduction
L’Hcy, les formes bisulfures mixtes et celles liées aux protéines présentes dans les échantillons sont
réduites en Hcy libre en utilisant du dithiothréitol (DTT).
Prot-SS-Hcy DTT
*R1-SS-Hcy Hcy
Hcy-SS-Hcy
*R1 est un résidu thiol.
Conversion enzymatique
L’Hcy présente dans l'échantillon à tester est transformée en S-adénosyl-L-homocystéine (SAH) en
utilisant de la SAH hydrolase et un excès d’adénosine (Ad).
SAH hydrolase
Hcy + Ad SAH + H2O
Le test immuno-enzymatique en phase solide suivant est basé sur la compétition entre la SAH présente
dans l'échantillon et la SAH fixée aux puits de la microplaque pour les sites de liaison présents sur un
anticorps monoclonal anti-SAH. Après élimination de l'anticorps anti-SAH non lié, on ajoute un
deuxième anticorps de lapin anti-souris marqué avec l’enzyme peroxydase de raifort (HRP). L’activité
peroxydase est mesurée par spectrophotométrie après addition de substrat, et l’absorbance est
inversement proportionnelle à la concentration de l’Hcy présente dans l'échantillon.
16Mises en garde et précautions
1. Réservé à l'usage diagnostique in-vitro.
2. Le réactif D contient 0,15% de merthiolate (< 0,074% de mercure).Manipuler et éliminer de
manière appropriée.
3. Le merthiolate à 0,01% est utilisé comme conservateur dans certains réactifs. Chaque trousse
contient moins de 0,028 % de mercure. Manipuler et éliminer de façon appropriée.
4. Le réactif F contient des anticorps de souris et le réactif G contient des anticorps de lapin.
5. Le réactif S contient de l'acide sulfurique 0,8 M et est classé comme "Danger". Manipuler et
éliminer de manière appropriée (voir section “Information relative à la sécurité du produit”).
6. Les étalons, les contrôles, le réactif A et le réactif E contiennent moins de 0,1% d’azide de sodium
comme conservateur. L’azide de sodium peut réagir avec les tuyaux en plomb ou en cuivre pour
former des azides de métal très explosifs. Lors de l’élimination, rincer avec une grande quantité
d’eau pour éviter toute accumulation d’azide.
7. Les contrôles contiennent des sérums provenant d'échantillons de sang humain. Les
matériaux de base ont été testés et trouvés négatifs au HBsAG (antigène de surface de l'hépatite
B), au HIVAg (antigène du VIH-1), à l'anticorps anti-VHC, à l'anticorps anti-VIH-1/2, à l'anticorps
anti-HTLV-1/2, et à l'anticorps anti-core du VHB (HBc). Néanmoins, la manipulation de dérivés
sanguins doit se faire conformément aux procédures recommandées pour la manipulation de
matériel infectieux. Se reporter à la publication HHS n° (CDC) 93-839518 ou aux directives
locales/nationales relatives aux procédures de sécurité en laboratoire.
8. Des réactifs portant des numéros de lot différents ne doivent pas être interchangés.
9. Ne pas utiliser la trousse après la date d'expiration figurant sur la boîte extérieure.
Attention : conformément à la législation fédérale des États-Unis, ce dispositif ne peut être vendu
que par un médecin ou sur prescription médicale.
Composants de la trousse
FHCY100 Trousse Axis® Homocysteine EIA, 96 puits.
Composants de
Soulution Description du composant Volume
la trousse
Tampon du test Tampon phosphate, azide de sodium 54ml
Adénosine/DTT Adénosine / dithiothréitol, acide citrique 3,5ml
S-adénosyl-L-homocystéine hydrolase
SAH-
recombinée, tampon Tris, glycérol, 3,5ml
hydrolase
méthylparaben
Inhibiteur
Merthiolate, tampon phosphate 55ml
enzymatique
Adénosine Adénosine désaminase, tampon phosphate,
55ml
désaminase azide de sodium, BSA, colorant rouge-phénol
Anticorps monoclonal de souris anti-S-adénosyl-
Anticorps anti-SAH 25ml
L-homocystéine, BSA, merthiolate
17Conjugué Conjugué enzymatique d'anticorps de lapin anti-
15ml
enzymatique souris, BSA, peroxidase de raifort, colorant bleu
Solution substrat N-méthyl-2-pyrrolidone, propyléneglycol 15ml
Solution d'arrêt Acide sulfurique 0,8 M 20ml
Tampon de lavage Tampon phosphate, merthiolate, Tween 20, BSA 60ml
S-adénosyl-L-homocystéine
Étalons (2, 4, 8, 15, 30, 50 µmol/l) dans un tampon avec 6 x 1,5ml
conservateur
Barrettes de 12 x 8
Enrobées de S-adénosyl-L-homocystéine
microtitrage wells
Le est concentré et doit être dilué (1+9) à l'eau purifiée avant l'emploi.
Tous les autres composants sont prêts à l'emploi.
FHCY200 Trousse de contrôle Axis® Homocysteine EIA
Composants de
Description du composant Volume
la trousse
7,0 µmol/l d'homocystéine dans des échantillons de sérum dilués
1,5ml
d'origine humaine, tampon phosphate et conservateur
12,5 µmol/l d'homocystéine dans des échantillons de sérum dilués
1,5ml
d'origine humaine, tampon phosphate et conservateur
25,0 µmol/l d'homocystéine dans des échantillons de sérum dilués
1,5ml
d'origine humaine, tampon phosphate et conservateur
Tous les contrôles sont prêts à l'emploi.
FHCY050 Tampon de lavage Axis® Homocysteine EIA
Composants de
Description du composant Volume
la trousse
Tampon phosphate, merthiolate, Tween 20, BSA 1000ml
Le est concentré et doit être dilué (1+9) à l'eau purifiée avant l'emploi.
Matériel nécessaire mais non fourni dans la trousse:
Contrôles homocystéine (voir section "Contrôles de qualité" pour plus d’information).
Tubes en plastique ou en verre pour le prétraitement des échantillons.
Pipettes / multipipettes : 25 µl, 100 µl, 200 µl et 500 µl ou multipipette à 8 canaux pour 100 µl et
200 µl
Fioles jaugées de 50 ml et 600 ml.
Incubateur, 37 °C
Laveur et lecteur (450 nm) pour microplaques
18Préparation et conservation des composants de la trousse
1. Les composants doivent être conservés au frais (2 à 8 °C). Conserver toutes les bouteilles verticales
et bien fermées. Les composants restent stables jusqu'à la date d'expiration lorsqu'ils sont
conservés et manipulés conformément aux instructions. Une fois les composants du kit Axis®
Homocysteine EIA ouvert, ils sont stables 12 semaines s'ils sont conservés à 2-8 °C.
2. La solution de prétraitement des échantillons doit être réalisée en mélangeant les réactifs A, B et
C (voir section "Procédure"). La solution reste stable pendant 1 heure et doit être fraîchement
préparée avant chaque essai.
3. Le tampon de lavage doit être dilué (1+9) avec de l’eau distillée avant l'emploi. Le tampon de
lavage préparé reste stable 4 semaines s'il est conservé à température ambiante (18 à 25 °C).
4. Les réactifs D et H sont conservés dans des bouteilles foncées pour éviter toute exposition à la
lumière.
5. Il est important que les barrettes de la microplaque soient conservées au sec, c'est-à-dire dans le
sachet scellé contenant des capsules dessiccatives, et conservées au réfrigérateur. Il faut au
minimum deux heures d'équilibration pour atteindre la température ambiante (18 à 25 °C). Laisser
les barrettes dans le sachet pendant l’équilibration de la température.
6. Il ne faut conserver que le nombre de barrettes nécessaires aux tests. Les barrettes non utilisées
doivent être conservées dans le sac scellé avec les capsules dessiccatives.
7. Eviter d'exposer la trousse à des températures supérieures à 37 °C, ceci pouvant dénaturer les
enzymes.
Recueil et préparation des échantillons
Avec le test Axis® Homocysteine EIA, on peut utiliser du plasma ou du sérum EDTA.
Comme la synthèse d’homocystéine se poursuit dans les globules rouges après le recueil, il est très
important de préparer les échantillons de la manière suivante:
Il faut laisser les échantillons de sérum coaguler pendant une période ne dépassant pas les 30
minutes avant la centrifugation et la séparation du sérum. Les échantillons de sérum doivent être
conservés dans la glace avant la séparation.
Les échantillons de plasma EDTA doivent être centrifugés ou conservés dans la glace
immédiatement après le prélèvement. Les échantillons de plasma peuvent être conservés dans la
glace jusqu’à 6 heures avant la séparation par centrifugation.
La consommation d'aliments peut affecter le taux d’homocystéine circulante. Les repas riches en
protéines donnent des valeurs en homocystéine supérieures et doivent donc être évités le jour
précédant le recueil d’échantillon.19, 20
Des procédures d’échantillonnage standardisées sont primordiales du fait des facteurs influençants
mentionnés ci-dessus.
Les échantillons décongelés doivent être bien mélangés avant l'emploi.
Les échantillons de plasma ou de sérum peuvent être conservés jusqu’à 12 semaines au réfrigérateur
(2 à 8 °C) et jusqu’à 3 semaines à température ambiante (18 à 25°C). Ils restent stables au moins 8
mois lorsqu’ils sont congelés à –20 °C.
19Limites
Si on utilise une station de pipetage automatique, un lavage approfondi des tuyaux est nécessaire
après l'addition de la réactif G colorée en bleue – de préférence avec de l’acide dilué, puis avec de
l’eau. Les restes de solution dans les tuyaux interfèrent avec les étapes suivantes du dosage, c'est-
à-dire l’addition de la réactif H.
La procédure de lavage est essentielle pour obtenir une bonne précision. Si un lavage manuel est
requis, utiliser 4 fois 350 µl au lieu de 3 fois 400 µl. Après le lavage, bien vider les puits sur des
serviettes absorbantes.
Eviter d'exposer la trousse à des températures supérieures à 37 °C, ceci pouvant dénaturer les
enzymes.
Les échantillons provenant de patients qui reçoivent un traitement médicamenteux comportant
de la S-adénosyl-méthionine peuvent donner des résultats faussement élevés en homocystéine.
Les échantillons provenant de patients qui ont reçu des préparations d’anticorps monoclonaux de
souris à titre diagnostique ou thérapeutique, peuvent contenir un anticorps humain anti-souris.
Cet anticorps, présent dans les échantillons de sérum ou de plasma, peut interférer dans les tests
immuno-enzymatiques qui utilisent des anticorps monoclonaux de souris. Ces échantillons ne
doivent donc pas être utilisés avec la trousse Axis® Homocysteine EIA.
Les échantillons provenant de patients qui prennent du méthotrexate, de la carbamazépine, de la
phénytoïne, de l'oxyde nitrique, des anticonvulsivants ou du triacétate de 6-azauridine, peuvent
donner des taux élevés d'homocystéine en raison de l'interférence avec le métabolisme de
l’homocystéine.
Procédure
Il convient de s'assurer que toutes les solutions et barrettes de microplaque soient amenées à -
température ambiante avant l'emploi. Il est recommandé de laisser la trousse à température ambiante
pendant la nuit. Nous recommandons d’analyser les étalons en double et de réaliser une nouvelle
courbe d'étalonnage pour chaque série de tests, afin d'éviter des variations entre les séries, en utilisant
des microplaquettes enrobées.
Procédure de prétraitement des échantillons
1. La solution de prétraitement des échantillons doit être préparée dans l'heure qui précède le début
du test. Volume nécessaire pour 10 échantillons (pas de volume mort calculé):
4,5 ml de
0,25 ml de
0,25 ml de Mélanger
2. Diluer les étalons et les échantillons / contrôles dans des tubes en plastique ou en verre, de la
manière suivante:
25 µl d'étalon/échantillon/contrôle
+ 500 µl de la solution de prétraitement des échantillons
Bien mélanger.
Incuber 30 minutes à 37 °C (boucher les tubes ou les couvrir avec du parafilm pendant
l’incubation).
20Remarque: Procéder à l’étape 3 avant que les échantillons ne soient refroidis.
3. Ajouter 500 µl de
Bien mélanger.
Incuber 15 minutes à 18-25 °C.
4. Ajouter 500 µl de
Bien mélanger.
Incuber 5 minutes à 18-25 °C.
Procédure des microplaques
5. Pipeter 25 µl d'étalon / échantillon / contrôle de l'étape 4 dans les puits des barrettes enrobées
de SAH.
6. Ajouter 200 µl de chaque puit.
Incuber 30 min à 18-25 °C.
Utiliser le couvercle joint pendant toutes les incubations.
7. Laver avec le tampon de lavage dilué ( + eau purifiée)
Utiliser 3 x 400 µl. Si un lavage manuel est requis, utiliser 4 fois 350 µl au lieu de 3 fois 400 µl.
Après le lavage, vider les puits sur des serviettes en papier.
8. Ajouter 100 µl de à chaque puit.
Incuber 20 min à 18-25 °C.
9. Laver avec le tampon de lavage dilué ( + eau purifiée).
Utiliser 3 x 400 µl. Si un lavage manuel est requis, utiliser 4 fois 350 µl au lieu de 3 fois 400 µl.
Après le lavage, vider les puits sur des serviettes en papier.
10. Ajouter 100 µl de à chaque puit.
Incuber 10 min à 18-25 °C.
11. Ajouter 100 µl de à chaque puit.
12. Agiter et lire à 450 nm dans les 15 minutes (un agitateur automatique de microplaques est
recommandé pour assurer un mélange correct).
Interprétation des résultats
Les résultats doivent être interprétés en prenant en considération tous les résultats des autres tests
et le tableau clinique du patient.
Nous recommandons d’utiliser une courbe logistique à quatre paramètres pour établir la courbe
d'étalonnage et pour calculer les échantillons inconnus.
Contrôles de qualité
Nous recommandons à chaque laboratoire d’utiliser un contrôle d’homocystéine de valeur connue.
Axis-Shield fournit une gamme de contrôles faibles, moyens et élevés. ( FHCY200).
Les contrôles contiennent de la L-homocystéine dans du sérum humain traité aux concentrations
suivantes:
Contrôle Taux moyen d'Hcy Plage d'Hcy
(µmol/l) (µmol/l)
7,0 5,6 – 8,4
12,5 10,0 – 15,0
25,0 20,0 – 30,0
21Plage de référence
La plage de référence doit être déterminée par chaque laboratoire pour confirmer les caractéristiques
de la population étudiée. Jusqu’à ce que le laboratoire ait analysé un nombre suffisant d'échantillons
pour établir ses propres valeurs de référence, on peut utiliser les données suivantes comme
références.
La concentration en Hcy dans le plasma ou le sérum de sujets sains varie avec l’âge, le sexe, la région
géographique et les facteurs génétiques. La littérature scientifique fait état de valeurs de référence
comprises entre 5 et 15 µmol/l pour les hommes et les femmes adultes; les hommes ont des valeurs
plus élevées que les femmes, et les femmes ménopausées ont des taux d'homocystéine plus élevés
que les femmes en préménopause.21, 22, 23 Les taux d'Hcy augmentent normalement avec l’âge,
donnant une plage de référence de 5 à 20 µmol/l chez les personnes âgées (> 60 ans).24 Dans les pays
où existent des programmes de supplémentation en acide folique, on peut observer des taux réduits
d'Hcy.25, 26
Les échantillons de 382 hommes et femmes (100 Scandinaves: 54 hommes âgés de 30 à 60 ans et 46
femmes âgées de 29 à 70 ans; 185 Hispaniques, principalement des hommes d'âge compris entre 20
et 65 ans; 97 Américains: 54 hommes âgés de 16 à 74 ans et 43 femmes âgées de 15 à 79 ans),
apparemment en bonne santé mais pour lesquels on ne disposait pas d'informations relatives à leurs
traitements médicamenteux actuels, à leur état de santé ou aux conditions de risque connues d’avoir
des taux d’homocystéine élevés, ont été testés à l'aide du test Axis® Homocysteine EIA. La valeur
médiane de la concentration en homocystéine était de 8,4 µmol/l chez les Scandinaves, de 8,9 µmol/l
chez les Hispaniques et de 9,3 µmol/l chez les Américains. La plage de référence pour l’homocystéine
a été basée sur un intervalle de confiance à 95% de 5 à 15 µmol/l pour la population scandinave, de
3,6 à 15,0 µmol/l pour la population américaine et de 2,9 à 16,0 µmol/l pour la population hispanique.
Plage de mesure
La plage d'étalonnage est de 2 à 50 µmol/l.
Caractéristiques de performance
Précision du test
La précision de l’Axis Homocysteine EIA a été evaluée conformément au document NCCLS EP5-T2. 3
niveaux de contrôles ont été dosés pendant 8 jours en réalisant 4 tests par série pour chaque niveau.
Les données relatives à la précision sont résumées dans le Tableau 1.
Tableau 1: Précision
Hcy moyenne Précision
Échantillons Précision totale
µmol/l intra-test
Control Low 6,1 8% 10 %
Control Medium 10,5 7% 9%
Control High 20,6 8% 10 %
Limite de quantification
La limite de quantification (CV < 20%) est de 1,0 µmol/l.
22Linéarité des échantillons dilués de plasma
Si la concentration en homocystéine d’un échantillon dépasse la plage de la courbe d'étalonnage,
l’échantillon doit être dilué avec le réactif A et réanalysé.
La linéarité a été évaluée en diluant quatre échantillons de patients de concentration élevée avec des
quantités variables de réactif A comme diluant.
L'analyse de régression linéaire a donné:
Pente: 0,98
Intercept: - 0,4 µmol/l
Coefficient de corrélation r2: 0,99
Comparaison des méthodes
L'Axis® Homocysteine EIA a été comparé à la méthode HPLC utilisée à l’Université de Bergen.27
Une comparaison de 164 échantillons de patients figurant dans une plage de 3 à 37 µmol/l
d’homocystéine a donné la régression linéaire reprise à la Figure 1.
Figure 1: Comparaison des methods
Substances interférentes
La bilirubine, l'hémoglobine, les lipides, les érythrocytes, les protéines et le fluorure de sodium ont été
ajoutés aux échantillons de plasma et leur interférence a été testée à l'aide d'Axis® Homocysteine EIA.
Le test a révélé moins de 10% d'interférence en présence de:
bilirubine (0,5 g/l), hémoglobine (10 g/l), triglycérides (10 g/l), érythrocytes (5,0% v/v), protéines
(80 g/l) et fluorure de sodium (10 g/l).
23Réactivité croisée
La réactivité croisée a été testée pour des substances qui peuvent interférer avec le test
Axis® Homocysteine EIA. Le test a révélé une réactivité croisée de 16% en présence de S-adénosyl-L-
méthionine (0,5 mmol/l) et une réactivité croisée inférieure à 1% en présence de: adénosine
(5,0 mmol/l), cystathionine (0,5 mmol/l), L-cystéine (100 mmol/l), glutathion (100 mmol/l) et
thiolactone (0,5 mmol/l).
Information relative à la sécurité du produit
ATTENTION
H314 – Provoque des brûlures de la peau et des lésions oculaires
DANGER graves.
PRÉVENTION
P264 – Se laver mains soigneusement après manipulation.
P280 – Porter des gants de protection/des vêtements de
protection/un équipement de protection des yeux/ du
visage.
RÉSPONSE
P303+361+353 - EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU (ou les cheveux):
Enlever immédiatement les vêtements contaminés. Rincer
la peau à l’eau/se doucher.
P305+351+338 – EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: rincer avec précaution
à l’eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de
contact si la victime en porte et si elles peuvent être
facilement enlevées. Continuer à rincer.
P405 - Garder sous clef.
24Inhalt
Verwendungszweck 25
Zusammenfassung und Erläuterung des Tests 25
Testprinzip 26
Vorsichtsmaßnahmen und Warnhinweise 27
Bestandteile des Kits 27
Vorbereitung und Lagerung der Kit Komponenten 29
Probenentnahme und -lagerung 29
Einschränkungen 30
Testdurchführung 30
Interpretation der Ergebnisse 31
Qualitätskontrolle 31
Referenzbereich 32
Messbereich 32
Leistungsdaten 32
Informationen zum sicheren Umgang mit den Produkten 34
Literaturhinweise 70
Verwendungszweck
Der Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (EIA) ist zur quantitativen Bestimmung der
Gesamtkonzentration von L-Homocystein in Humanserum und -plasma vorgesehen. Die
Homocysteinwerte unterstützen die Diagnose und Behandlung von Patienten mit Verdacht auf
Hyperhomocysteinämie oder einer Homocystinurie.
Zusammenfassung und Erläuterung des Tests
Homocystein (Hcy) ist eine thiolhaltige Aminosäure, die durch intrazelluläre Demethylierung von
Methionin entsteht. Hcy wird ins Plasma exportiert, wo es zum größten Teil in oxidierter Form an
Plasmaproteine gebunden zirkuliert.1, 2, 3, 4 Dabei liegen auch kleinere Mengen an reduziertem
Homocystein und das Dilsulfid Homocystin (Hcy-SS-Hcy) vor. Die Gesamtkonzentration an
Homocystein entspricht der Summe aller im Plasma bzw. im Serum gefundenen Hcy-Arten (frei und
proteingebunden).
Hcy wird entweder zu Cystein oder zu Methionin metabolisiert. Auf dem Weg der Vitamin-B6-
abhängigen Transsulfurierung wird Hcy irreversibel zu Cystein katabolisiert. Ein großer Teil des Hcy
wird durch das Folat- und Cobalamin-abhängige Enzym Methionin-Synthase zu Methionin
remethyliert. Hcy sammelt sich an und wird in das Blut ausgeschieden, sobald es zu einer
Beeinträchtigung dieser Reaktionen kommt.2,4
Stark erhöhte Hcy-Konzentrationen werden bei Patienten mit Homocystinurie festgestellt. Dieses ist
eine seltene genetische Störung der am Hcy-Metabolismus beteiligten Enzyme. Patienten mit
Homocystinurie leiden an geistiger Retardierung, frühzeitiger Arteriosklerose sowie arterieller und
venöser Thromboembolie.1, 5 Eine Hcy-Senkungstherapie verbessert die Prognose für diese Krankheit.5
Es gibt darüber hinaus auch andere, weniger schwere genetische Defekte, die zu mäßig erhöhten Hcy-
Werten führen.6, 7, 8
25In epidemiologischen Studien wurde der Zusammenhang zwischen den Hcy-Konzentrationen im Blut
und kardiovaskulären Erkrankungen (CVD) untersucht. Im Ergebnis einer Metaanalyse von 27 dieser
Studien unter Berücksichtigung von mehr als 4000 Patienten wurde eingeschätzt, dass ein Hcy-Anstieg
von 5 µmol/l mit einer Odds-Ratio für CVD von 1,6 (bei Männern) bzw. 1,8 (bei Frauen) verbunden ist.
Dieses ist vergleichbar mit der Odds-Ratio bei einem Cholesterinanstieg um 0,5 mmol/l (20 mg/dl).
Darüber hinaus wurde auch ein starker Zusammenhang zwischen Homocystein Konzentration und
periphärer arterieller Verschluss-krankheit deutlich.9
Bestimmte Patientengruppen mit Anämie und/oder Asthenie zeigen ebenfalls erhöhte Hcy-Werte in
Plasma oder Serum.10, 11
Bei Patienten mit chronischen Nierenerkrankungen kommt es infolge arteriosklerotischer CVD zu einer
übermäßigen Morbidität und Mortalität. Bei diesen Patienten wird häufig eine erhöhte Hcy-
Konzentration im Blut beobachtet. Zwar herrscht bei diesen Patienten möglicherweise ein Mangel an
den am Hcy-Metabolismus beteiligten Vitaminen, die erhöhten Hcy-Werte ergeben sich aber zumeist
aus der gestörten Eliminierung des Homocysteins aus dem Blut durch die Nieren.12, 13
Medikamente wie Methotrexat, Carbamazepin, Phenytoin, Distickstoffoxid und Penicillin
beeinträchtigen den Hcy-Metabolismus und können zu erhöhten Hcy-Werten führen.14, 15
Testprinzip
Der Axis® Homocysteine EIA ist ein Enzymimmunassay zur Bestimmung der Hcy-Konzentration im
Blut.16 Dabei wird proteingebundenes Hcy zu freiem Hcy reduziert und vor dem Immunoassay in einem
separaten Vorgang enzymatisch zu S-Adenosyl-L-Homocystein (SAH) umgewandelt.17 Das Enzym ist
kennzeichnend für die L-Form des Homocysteins, der einzigen im Blut präsenten Form.
Reduktion
Hcy, gemischtes Disulfid und proteingebundene Formen von Hcy werden in der Probe durch den
Einsatz von Dithiothreitol (DTT) zu freiem Hcy reduziert.
Prot-SS-Hcy DTT
*R1-SS-Hcy Hcy
Hcy-SS-Hcy
*R1: Thiolrückstände jeglicher Art.
Enzymatische Umwandlung
Hcy wird in der Untersuchungsprobe durch die SAH-Hydrolase und das überschüssige Adenosin (Ad)
zu S-Adenosyl-L-Homocystein umgewandelt.
SAH-hydrolase
Hcy + Ad SAH + H2O
Der folgende Festphasen-Immunoassay basiert auf der kompetitiven Reaktion um die Bindungstellen
eines monoklonalen Anti-SAH-Antikörpers zwischen dem SAH in der Probe und dem immobilisierten
SAH, das an die Wände der Mikrotiterplatte gebunden ist. Nach dem Entfernen der ungebundenen
Anti-SAH-Antikörper wird ein zweiter, mit Meerettichperoxidase markierter Kaninchen-Anti-Maus-
Antikörper, hinzugefügt. Nach dem Hinzufügen des Substrats wird die Peroxidaseaktivität durch ein
spektrophotometrisches Verfahren gemessen, wobei sich die Absorbtion umgekehrt proportional zur
Hcy-Konzentration in der Probe verhält.
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