CIC-C1Q Circulating Immune Complexes ELISA - Buhlmann Diagnostics Corp
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CIC-C1Q
Circulating Immune Complexes
ELISA
EK-CIC 96 wells
Release date 2019-03-27
BÜHLMANN LABORATORIES AG English page 2
Baselstrasse 55 Deutsch Seite 5
CH - 4124 Schönenbuch, Switzerland
Français page 9
Tel.: +41 61 487 1212
Fax: +41 61 487 1234 Italiano pagina 13
info@buhlmannlabs.ch Español página 16ENGLISH
INTENDED USE STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS
The BÜHLMANN CIC-C1Q EIA is intended for the Unopened Reagents
quantitative in vitro diagnostic determination of circulating Store at 2-8°C except for calibrators and controls which must be stored
immune complexes (CIC) in serum and plasma of patients at -20°C or below. Do not use past kit expiration date.
with various autoimmune and other CIC-related diseases
Opened / Reconstituted Reagents
(1-3).
Return unused strips immediately to the foil pouch
containing the desiccant packs and reseal along the
PRINCIPLE OF THE ASSAY Microtiter Plate
entire edge of zip-seal. Store until expiration date at
2-8°C.
Circulating immune complexes from patient sera, plasma or
calibrators and controls are incubated with human C1q Wash Buffer Store at 2-8°C until expiration date.
adsorbed onto microtiter wells. After a washing step, an Calibrators Stable at –20°C until expiration date. For storage shorter
alkaline phosphatase (aPase) labeled conjugate (Protein A) than 3 months calibrators and controls can be stored at
Controls 2-8°C
is added, which binds to the Fc region of human IgG. After
another washing step, the enzyme substrate (para- Incubation Buffer
nitrophenyl-phosphate or pNPP) is pipetted followed by a Enzyme Label
Store at 2-8°C until expiration date.
stopping step (4-6). The absorption is measured at 405 nm. Substrate Solution
Stop Solution
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION Table 2
Reagents Quantity Code Reconstitution
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
Microtiter Plate
12 x 8-well B-CIC-MP Ready to use
Precoated with human C1q • Precision pipettes with disposable tips for 20 µL, 100 µL
Plate Sealer 3 pieces and 1000 µL.
Wash Buffer • Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the
1 bottle Dilute with 900 mL
Concentrate (10x) B-CIC-WB preparation of sample dilutions.
100 mL of deionized water
with preservatives • 1000 mL cylinder for the dilution of the wash buffer
Incubation Buffer 1 bottle concentrate.
B-CIC-IB Ready to use
with preservatives 100 mL • Microtiter plate washer or squeeze bottle for wash
Calibrators A to E*) buffer.
5 vials
Aggregated-IgG in a buffer B-CIC-CASET Ready to use • Blotting paper.
1 mL
matrix with preservatives
• Microtiter plate rotator.
Control Low / High**)
2 vials B-CIC- • Microtiter plate reader for measurement of absorbance
Aggregated-IgG in a buffer Ready to use
1 mL CONSET at 405 nm
matrix with preservatives
Enzyme Label
Proteine A conjugated 1 vial PRECAUTIONS
aPase in a protein-based B-CIC-EL Ready to use
11 mL
buffer matrix with Safety precautions
preservatives
• The microtiter-plate (B-CIC-MP), calibrators (B-CIC-
pNPP Substrate 1 vial
with stabilizing pellets B-PNPP Ready to use CASET) and controls (B-CIC-CONSET) of this kit
11 mL contain components of human origin. Although tested
Stop Solution 1 vial Ready to use and found negative for HBV surface antigen, HCV and
B-NAOH
1 N sodium hydroxide 11 mL Corrosive agent HIV1/2 antibodies, the reagents should be handled as if
Table 1 capable of transmitting infections and should be
*)
The calibrators A ,B, C, D and E contain 50, 20, 10, 4 and 1 µg equivalents handled in accordance with good laboratory practices
of aggregated-IgG per mL (µg Eq/mL), respectively.
using appropriate precautions.
**)
The controls contain lot-specific amounts of equivalents of aggregated-
IgG per mL (µg Eq/mL). Refer to the QC data sheet added to the kit for • Substrate and stop solution: Avoid contact with eyes,
exact concentrations. skin and clothes. Wear suitable protective clothing,
gloves and eye protection. After contact with eyes or
skin, wash immediately with plenty of water.
• Unused solutions should be disposed of according to
local state and federal regulations.
Technical precautions
• Components must not be used after the expiry date
printed on the labels. Do not mix different lots of
reagents.
• Avoid contamination of reagents.
Release date: 2019-03-27 2/24 BÜHLMANN CIC-C1Q• Microwells cannot be re-used. 8. Cover the plate with a plate sealer, place the plate on a
• It is important to read through the instructions for use plate rotator set at 400-600 rpm and incubate for 30
prior to commencing the test. Reliable results will be minutes ± 5 minutes at 18-28°C.
obtained only if this Instruction for Use is followed 9. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells
accurately. and wash three times using at least 300 µL of wash
buffer per well. Empty the wells and strike the plate
• The substrate solution is ready to use. Do not vortex or firmly onto blotting paper.
try to homogenize the stabilizing pellets prior to use.
Important: Allow the pNPP substrate solution to reach
18-28°C.
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE 10. Pipet 100 µL of the pNPP substrate solution to all wells.
The procedure calls for 50 µL of blood per duplicate 11. Cover the plate with a plate sealer, place the plate on a
determination. Collect blood into plain tubes, avoid plate rotator set at 400-600 rpm, protect the plate from
hemolysis, mix by inverting sample tube several times and direct light and incubate for 30 ± 5 minutes at 18-28 °C.
leave to clot for 45 minutes at room temperature (18-28°C)
12. Pipet 100 µL of stop solution to all wells. Remove air
protected from light. Centrifuge at 1800 x g for 15 minutes
bubbles with a pipette tip. Proceed to step 13 within
at room temperature (18-28°C) and collect the serum.
30 minutes.
Samples may be stored at 2-8 °C for up to 7 days. If
samples are to be stored for a longer period of time, they 13. Read the absorbance at 405 nm in a microtiter plate
should be kept at ≤–20°C. reader.
ASSAY PROCEDURE QUALITY CONTROL
Important: Allow all reagents to 18-28°C prior to use. A thorough understanding of this package insert is
necessary for the successful use of the product. Reliable
1. Dilute all patient samples 1:50 with incubation buffer
results will be obtained only by using precise laboratory
(e.g. 20 µL of serum or plasma + 980 µL of incubation
techniques (current GLP guidelines) and accurately
buffer) and mix well. Allow diluted samples to stand for
following this package insert.
15 minutes at 18-28°C prior to pipetting in step 4c.
Since there is no control serum for CIC commercially
2. Prepare a plate with sufficient strips to test the required available, we recommend using a positive serum pool for
number of calibrators, controls and samples. Remove internal quality controls.
excess strips from the holder and re-seal them in the foil All controls must fall within established confidence limits.
pouch together with the desiccant packs without delay. The confidence limits for the controls are lot-specific and
Store refrigerated. printed on the additional data sheet.
3. Wash the coated wells twice using at least 300 µL of The reproducibility of standard curve parameters and
wash buffer per well. Empty the wells and strike the control values should be within established limits of
plate firmly onto blotting paper. laboratory acceptability. If the performance of the assay
4a. Pipet 100 µL of incubation buffer in duplicate into wells does not correlate with the established limits and repetition
A1+A2. excludes errors in technique, check the following issues: i)
pipetting, temperature controlling and timing devices ii)
Pipet 100 µL of calibrator A in duplicate into wells
ELISA reader settings iii) expiration dates of reagents iv)
B1+B2.
storage and incubation conditions v) pNPP substrate
Pipet 100 µL of calibrator B in duplicate into wells solution should be colorless vi) purity of water.
C1+C2.
Pipet 100 µL of calibrator C in duplicate into wells RESULTS AND CALCULATION
D1+D2.
Pipet 100 µL of calibrator D in duplicate into wells Standard curve
E1+E2. • Record the absorbance at 405 nm for each calibrator
Pipet 100 µL of calibrator E in duplicate into wells and blank well.
F1+F2. • Average the duplicate values, subtract the average of
4b. Pipet 100 µL of the low control in duplicate into wells the blank wells and record averages (= corrected
G1+G2. average absorbance).
Pipet 100 µL of the high control in duplicate into wells • Plot the absorbance (vertical axis) versus the CIC
H1+H2. concentration in µg Eq/mL of the calibrators (horizontal
4c. Pipet 100 µL of each diluted sample (1:50) in duplicate axis) using log/log graph paper.
into the subsequent wells. • Draw the best fitting curve or calculate the standard
5. Cover the plate with a plate sealer, place the plate on a curve using a four parameter algorithm.
plate rotator set at 400-600 rpm and incubate for 1 hour
± 5 minutes at 18-28°C. Samples and controls
6. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells • Record the absorbance at 405 nm for each sample and
and wash three times using at least 300 µL of wash control well.
buffer per well. Empty the wells and strike the plate • Average the duplicate values, subtract the average of
firmly onto blotting paper. the blank wells and record the averages (=corrected
7. Pipet 100 µL of enzyme label to all wells. average absorbance).
Release date: 2019-03-27 3/24 BÜHLMANN CIC-C1Q• Locate the corrected absorbance value of the sample of 18 to 70 years). 192 samples were assayed according to
on the vertical axis, draw a horizontal line intersecting the assay procedure and the results shown in table 15,
the standard curve and read the CIC concentration (µg expressed in µg Equivalent per ml (µg Eq/mL), were
Eq/ml) from the horizontal axis. obtained.
See table 11 and figure 1 for an example of results and Proposed cut-off value: A total of 10 strongly elevated
standard curve. These results and standard curves are for values (> mean+3SD) from the results of the 192 apparently
demonstration purposes only. A standard curve must be healthy normal blood donors were eliminated in three
generated for each set of samples to be assayed. iterative cycles. This resulted in a theoretical cut-off value
(mean + 2 SD) of 3.2 µg Eq/mL.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS Borderline and positive: For practical reasons we
Intra-Assay Precision (Within-Run): 3.6%. The intra- recommend that values between 3.2 and 5.0 µg Eq/mL
should be regarded as borderline results (grey zone).
assay precision was calculated from the results of 20 pairs
of values obtained in a single run. The values are Values above 5.0 µg Eq/mL should be regarded as
presented in µg Eq/mL (table 12) positive.
Inter-Assay Precision (Run-to-Run): 11.3%. The inter- General limitations of CIC normal ranges: elevated
assay precision was calculated from the results of 3 pairs ranges of CIC are known in up to 10% of normal blood
of values obtained in 20 different runs. The values are donors without any clinical manifestations (true negatives
presented in µg Eq/ml (table 13). outside the normal range) (7, 8). This stands in good
Dilution Linearity/Parallelism: 104.8%. Human serum agreement with our results: 6 (3.1 %) of 192 normal donor
samples containing low and high titers of CIC were diluted samples were positive in the CIC ELISA and 14 (7.3 %)
with incubation buffer and subsequently assayed according were within the grey zone.
to the assay procedure. The values are presented in µg
Eq/mL (table 14). PERFORMANCE LIMITATIONS
Plasma/Serum comparison: Human plasma and serum • Interferences: Lipemic, hemolytic and icteric samples
samples from 47 donors were diluted (1:50) with incubation should not be used in this assay. Lipemic samples can
buffer and subsequently assayed according to the assay be avoided by asking patients to fast for at least 12
procedure. All negative (n=27) and all borderline (n=10) hours prior to the sample being taken.
serum samples were negative or borderline, respectively
when measured in EDTA plasma. The same was true for • Application: The reagents supplied with this kit are
heparin plasma (n=20). Ten positive serum samples optimized to measure circulating immune complexes in
showed a very high correlation (r=0.978) to the plasma human serum or plasma.
samples of the same donor. Therefore CIC can be tested • Assessment: The amount of circulating immune
either in serum or plasma samples. complexes should be used as supplementary data
Standardization: The calibrators of the BÜHLMANN CIC- available to the physician in establishing a diagnosis.
C1Q EIA Kit were calibrated against a reference • Results. Values obtained with different assay methods
preparation of aggregated human IgG, which was prepared cannot be compared directly.
under the auspices of WHO (Geneva Section). • Hook effect: No hook effect was observed up to
Detection Limit: 50'000 µg Eq/mL.
Limit of Blank (LoB): 0.58 μg Eq/mL. Twenty duplicates of • Expected values: The proposed cut off values should
incubation buffer (reagent blank) were assayed in a single be used as guidelines only. It is recommended that
run. Mean and standard deviation were calculated for the each laboratory establishes its own reference intervals.
absorbance values. The minimum detectable dose of CIC
complexes was calculated to be 0.58 µg Eq/mL by adding
two standard deviations to the mean absorbance of the
reagent blank (incubation buffer) and intersecting this value
with the standard curve obtained in the same run.
Limit of Quantification (LoQ):DEUTSCH
ANWENDUNGSZWECK LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN
Der BÜHLMANN CIC-C1Q EIA Test wird gebraucht für die Ungeöffnete Reagenzien
direkte und quantitative in vitro diagnostische Bestimmung Lagerung bei 2-8°C außer Kalibratoren und Kontrollen bei -20°C oder
von zirkulierenden Immunkomplexen (CIC) in Serum oder darunter. Zu verwenden bis zum Verfallsdatum
Plasma von Patienten mit verschiedenen Autoimmun- und
Geöffnete / Rekonstituierte Reagenzien
anderen CIC-abhängigen Krankheiten (1-3).
Ungebrauchte Streifen sofort in die mit Dessikator
Mikrotiter-Platte versetzte Packung zurückbringen. Packung gut
PRINZIP DER METHODE verschliessen. Bis zum Verfallsdatum bei 2-8°C haltbar.
Zirkulierende Immunkomplexe (CIC) von Patientenproben Waschpuffer Bis zum Verfallsdatum bei 2-8°C lagern.
(Serum oder Plasma), Kalibratoren und Kontrollen werden in Kalibratoren bei -20°C bis zum Verfallsdatum haltbar. Bei einer
der mit humanem C1q-beschichteten Mikrotiter-Platte Lagerung kürzer als 3 Monate, können diese bei 2-8°C
Kontrollen gelagert werden.
inkubiert. Nach einem Waschschritt, wird Protein A, welches
mit alkalischer Phosphatase (aPase) konjugiert ist und die Inkubationspuffer
Fc Region von humanem IgG bindet, zu der Platte Enzymmarker
Bis zum Verfallsdatum bei 2-8°C lagern.
zugegeben. Nach einem weiteren Waschschritt wird das pNPP-Substrat
Enzymsubstrat (para-Nitrophenylphosphat; pNPP) zu der Stopp-Lösung
Platte zugegeben. Die Färbereaktion wird mit einer Stopp- Tabelle 4
Lösung beendet. Der CIC-Titer wird durch die Messung der
Absorption bei 405 nm ermittelt (4-6). ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND
HILFSMITTEL
GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG
• Präzisionspipetten mit Einwegspitzen für 20 µL, 100 µL
Reagenz Inhalt Art.-Nr. Rekonstitution und 1000 µL.
Mikrotiter-Platte • Polystyren oder Polypropylen Einwegröhrchen zur
8 x 12 Wells B-CIC-MP Gebrauchsfertig
Beschichtet mit humanem C1q Vorbereitung der Probenverdünnung.
Abdeckfolien 3 Stück • 1000 mL Zylinder zur Verdünnung des Waschpuffers.
Waschpuffer Konzentrat Mit 900 mL • Mikrotiter-Platten-Waschgerät oder Spritzflasche für
1 Flasche
(10x) B-CIC-WB deionisiertem
100 mL Waschpuffer.
Mit Konservierungsstoffen H2O verdünnen
• Saugfähiges Papier.
Inkubationspuffer 1 Flasche
B-CIC-IB Gebrauchsfertig • Mikrotiter-Platten-Schüttler.
Mit Konservierungsstoffen 100 mL
Kalibratoren A-E*) • Microtiter-Platten-Photometer mit optischem Filter
Aggregiertes IgG in einer
5 Flaschen B-CIC- (405 nm).
Gebrauchsfertig
Puffermatrix mit 1 mL CASET
Konservierungsstoffen VORSICHTSMASSNAHMEN
Kontrolle tief und hoch **)
2 Flaschen B-CIC- Sicherheitsmassnahmen
aggregiertes IgG in einer Gebrauchsfertig
Puffermatrix mit 1 mL CONSET
• Die Mikrotiterplatte (B-CIC-MP), Kalibratoren (B-CIC-
Konservierungstoffen
CASET) und Kontrollen (B-CIC-CONSET) enthalten
Enzymmarker
Komponenten menschlicher Herkunft. Obwohl sie
1 Flasche
Mit aPase gekoppeltes Protein B-CIC-EL Gebrauchsfertig negativ auf HBV Oberflächenantigen, HCV und HIV1/2
A in Puffermatrix mit 11 mL
Konservierungstoffen
Antikörper getestet wurden, sollten sie gemäss Good
Laboratory Practice als potentiell infektiös behandelt
pNPP-Substrat 1 Flasche
B-PNPP Gebrauchsfertig werden und die entsprechenden Sicherheits-
mit stabilisierenden Pellets 11 mL vorkehrungen getroffen werden.
Stopp-Lösung 1 Flasche Gebrauchsfertig
B-NAOH • Substrat- und Stopp-Lösung: Berührung mit den Augen,
1 N Natriumhydroxid 11 mL Korrosiv
der Haut und der Bekleidung vermeiden.
Tabelle 3 Entsprechende Schutzbekleidung tragen (Schutzbrillen,
*)
Die Kalibratoren A, B, C, D und E enthalten 50, 20, 10, 4 und 1 µg
Equivalente aggregiertes IgG pro ml (µg Eq/mL). Handschuhe und Labormantel). Nach Berührung, sofort
**)
Die Kontrollen enthalten Lot-spezifische Mengen von Equivalente an mit viel Wasser spülen.
aggregierten IgG pro ml (µg Eq/mL). Siehe zusätzliches Kontrollenblatt für
die genauen Konzentrationen.
• Ungebrauchte Lösungen sollten gemäss der
gesetzlichen Bestimmungen entsorgt werden.
Release date: 2019-03-27 5/24 BÜHLMANN CIC-C1Q4c. Zweimal 100 µL von den verdünnten Serumproben in
Technische Vorsichtsmassnahmen
die nächsten Mikroküvetten pipettieren.
• Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Verfallsdatums 5. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken und
nicht mehr verwendet werden. 1 Stunde (± 5 Minuten) bei 18-28°C auf einem
• Mischen Sie nicht Reagenzien verschiedener Kit lots. Mikrotiter-Platten-Schüttler bei 400-600 rpm inkubieren.
• Vermeiden Sie eine Kontamination der Reagenzien 6. Abdeckfolie entsorgen und die Mikroküvetten entleeren
• Mikrotiter-Platten-Streifen dürfen nicht wiederverwendet und dreimal mit jeweils ≥300 µL Waschpuffer waschen.
werden. Platte durch Ausschlagen auf saugfähigem Papier
sorgfältig trocknen.
• Es ist wichtig, vor Beginn des Tests die Arbeitsanleitung
sorgfältig zu lesen. Verlässliche Ergebnisse werden nur 7. 100 µL Enzymmarker zu jeder Mikroküvette zugeben.
erzielt, wenn diese Anleitung sorgfältig ausgeführt wird. 8. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken und
30 ± 5 Minuten bei 18-28°C auf einem Mikrotiter-
• Die pNPP Substratlösung ist gebrauchsfertig. Bitte nicht
Platten-Schüttler bei 400-600 rpm inkubieren.
versuchen, die stabilisierenden Pellets vor Gebrauch zu
vortexen oder anderweitig zu homogenisieren. 9. Abdeckfolie entsorgen und die Mikroküvetten entleeren
und dreimal mit jeweils ≥300 µL Waschpuffer waschen.
UNTERSUCHUNGSMATERIAL UND LAGERUNG Platte durch Ausschlagen auf saugfähigem Papier
sorgfältig trocknen.
Der Test benötigt 50 µL Blut pro Doppelmessung. Die
Wichtig: pNPP-Substratlösung auf 18-28°C erwärmen.
Blutproben in den entsprechenden Röhrchen sammeln,
Hämolyse vermeiden, durch mehrmaliges Invertieren die 10. 100 µL pNPP-Substrat zu jeder Mikroküvette zugeben.
Blutprobe mischen und danach lichtgeschützt während 45 11. Mikrotiter-Platte mit Abdeckfolie abdecken und 30 ± 5
Minuten bei Raumtemperatur (18-28°C) gerinnen lassen. Minuten bei 18-28°C auf einem Mikrotiter-Platten-
15 Minuten bei 18-28°C und 1800 x g zentrifugieren, Schüttler bei 400-600 rpm inkubieren. Platte vor
danach Serum sammeln. direktem Licht schützen.
Serumproben können bei 2-8°C bis 7 Tagen gelagert 12. 100 µL Stopp-Lösung zu jeder Mikroküvette zugeben
werden. Falls eine längere Haltbarkeit erwünscht ist, sollten und allfällige Luftbläschen mit Pipettenspitzen
sie bei ≤–20°C gelagert werden. entfernen.
13. Optische Dichte bei 405 nm innerhalb der nächsten 30
ARBEITSANLEITUNG Minuten messen.
Wichtig: Die Kit-Reagenzien vor Gebrauch auf 18-28°C
bringen. QUALITÄTSKONTROLLE
1. Patientenproben mit Inkubationspuffer 1:50 verdünnen Ein vollständiges Verständnis dieser Testpackungsbeilage
(z.B. 20 µL Serum + 980 µL Inkubationspuffer) und gut ist für den erfolgreichen Gebrauch des Produktes
mischen. Verdünnte Proben vor dem Pipettieren vom notwendig. Zuverlässige Resultate werden nur erreicht,
Schritt 4c 15 Minuten lang bei 18-28°C stehen lassen. durch die Anwendung „Guter Laborpraxis“ (aktuelle GLP
2. Eine Mikrotiter-Platte mit ausreichenden Streifen für das Richtlinien) und die Einhaltung der Arbeitsanleitung.
Testen der gewünschten Kalibratoren, Kontrollen und Da es kein kommerziell erhältliches Kontrollserum für CIC
Proben vorbereiten. Ungebrauchte Streifen vom Halter gibt, wird empfohlen, positive Serumproben (Pool) als
entfernen und sofort mit dem Dessikator einpacken und interne Qualitätskontrolle anzuwenden.
gekühlt lagern. Alle Kontrollen müssen im etablierten Vertrauensbereich
3. Mikroküvetten zweimal mit jeweils ≥300 µL Waschpuffer liegen. Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind Lot-
waschen. Waschpuffer dekantieren und Platte durch spezifisch und sind auf dem zusätzlichen Kontrollblatt
Ausschlagen auf saugfähigem Papier sorgfältig angegeben.
trocknen. Die Reproduzierbarkeit der Eichkurvenparameter und der
Kontrollwerte sollte innerhalb des etablierten Erwartungs-
4a. Zweimal 100 µL Inkubationspuffer in die Mikroküvetten
bereiches liegen. Falls die Leistungsmerkmale des Testes
A1 und A2 pipettieren.
nicht mit dem etablierten Erwartungsbereich übereinstimmt
Zweimal 100 µL Kalibrator A in die Mikroküvetten B1 und wiederholte Messungen ein technisches Problem
und B2 pipettieren. ausschliessen, sind folgende Bedingungen zu überprüfen:
Zweimal 100 µL Kalibrator B in die Mikroküvetten C1 i) Pipettierung, Temperatur- und Zeitmessende Geräte, ii)
und C2 pipettieren. Photometer Eichung, iii) Verfallsdaten der Reagenzien, iv)
Zweimal 100 µL Kalibrator C in die Mikroküvetten D1 und Lagerung- und Inkubations-Bedingungen, v) die pNPP
D2 pipettieren. Substratlösung sollte farblos sein, vi) Wasserreinheit.
Zweimal 100 µL Kalibrator D in die Mikroküvetten E1
und E2 pipettieren.
Zweimal 100 µL Kalibrator E in die Mikroküvetten F1
und F2 pipettieren.
4b. Zweimal 100 µL Kontrolle Tief in die Mikroküvetten G1
und G2 pipettieren.
Zweimal 100 µL Kontrolle Hoch in die Mikroküvetten H1
und H2 pipettieren.
Release date: 2019-03-27 6/24 BÜHLMANN CIC-C1QRESULTATE Standardisierung: Die Kalibratoren des BÜHLMANN CIC-
Eichkurve C1Q EIA Testes wurden gegen eine Referenzpräparation
von aggregiertem IgG kalibriert, welche unter der Feder-
• Optische Dichte aller mit Kalibrator oder Blank gefüllten
führung der WHO (Genfer Sektion) hergestellt wurde.
Wells bei 405 nm messen.
Nachweisgrenze:
• Zur Ermittlung der „korrigierten Absorptionsmittelwerte“
Limit of Blank (LoB): 0.58 µg Eq/mL. Zwanzig Doppel-
wird der Mittelwert aus den Doppelmessungen
messungen mit Inkubations-Puffer (Blank) wurden im
berechnet und der Mittelwert des Blankes von
gleichen Testansatz durchgeführt. Mittelwert und Standard-
demjenigen der Kalibratoren subtrahiert.
abweichung der Absorptionswerte wurden berechnet. Die
• Korrigierte Absorptionsmittelwert (Vertikalachse) gegen minimale, nachweisbare CIC-Menge wurde als 0.58 µg
die CIC-Konzentration der Kalibratoren in µg Eq/mL Eq/mL definiert, indem zwei Standardabweichungen zum
(Horizontalachse) auf einem logarithmischen (log/log) Absorptionsmittelwert des Blanks addiert wurden und der
Papier auftragen CIC-Titer aus diesem erhaltenen Absorptionswert mit Hilfe
• Optimale „best fitting curve“ Eichkurve zeichnen oder der im gleichen Testansatz erhaltenen Eichkurve ermittelt
mit einem „vier Parameter“ Algorithmus berechnen. wurde.
Proben und Kontrollen Limit of Quantification (LoQ):LEISTUNGSEINSCHRÄNKUNGEN • Interferenzen: Lipämische, hämolytische oder ikterische Blutproben sollten nicht verwendet werden. Lipämische Proben können verhindert werden, indem der Patient mindestens 12 Stunden vor der Blutentnahme keine Nahrung zu sich nimmt. • Applikation: Die Reagenzien dieses Kits sind für die Messung von zirkulierenden Immunkomplexen in human Serum oder Plasma optimiert worden. • Beurteilung: Die gemessene Menge zirkulierender Immunkomplexe sollte als zusätzliche Information für den behandelnden Arzt dienen, um eine Diagnose stellen zu können. • Ergebnisse: Werte, welche mit unterschiedlichen Testmethoden erhalten wurden, können nicht direkt miteinander verglichen werden. • Hook Effekt: Kein Hook Effekt konnte bis 50'000 µg Eq/mL beobachtet werden. • Referenzintervalle: Die angegebenen Werte dienen nur als Richtlinie. Es wird empfohlen, dass jedes Labor Normalbereiche ermittelt, die der eigenen Patientenpopulation entsprechen. Release date: 2019-03-27 8/24 BÜHLMANN CIC-C1Q
FRANCAIS
DOMAINE D’UTILISATION STOCKAGE ET PEREMPTION DES REACTIFS
La trousse BÜHLMANN CIC-C1Q EIA a été conçue pour la Réactifs non ouverts
détermination diagnostique quantitative in vitro des Stables à 2-8°C jusqu’à la date de péremption imprimée sur l’étiquette,
immuno-complexes circulants (CIC) présents dans le sauf pour le calibrateur et les côntroles qui doivent être stockés
à -20°C au minimum.
sérum ou le plasma de patients atteints de diverses
maladies auto-immunes et d’autres maladies ayant un lien Réactifs ouverts / Reconstitués
avec les CIC (réf. 1-3). Replacer immédiatement les barrettes de 8
puits non utilisées dans la pochette contenant
Microplaque le dessiccateur puis la refermer soigneusement.
PRINCIPE DU DOSAGE Stable à 2-8°C jusqu’à la date de péremption
imprimée sur l’étiquette.
Les immuno-complexes circulants du sérum, du
calibrateur, ou du plasma de patient sont incubés avec de Tampon de lavage
Stables à 2-8°C jusqu’à la date de péremption.
dilué
la C1q humaine qui recouvre la microplaque. Après un
lavage, la protéine A conjuguée à la phosphatase alcaline Calibrateurs Stables à -20°C jusqu’à la date de péremption.
Pour une stockage pendant 3 mois Calibrateur
(aPase) est ajoutée, liant la partie constante Fc des IgG Contrôles et Contrôles peuvent être stockés à 2-8°C
humaines. Après un second lavage, le substrat para-
Tampon d’incubation
nitrophénylphosphate (pNPP) de la aPase est ajouté. La
réaction est arrêtée et l’absorption est mesurée à 405 nm Marqueur enzymatique
Stables à 2-8°C jusqu’à la date de péremption.
(réf. 4-6). Substrat pNPP
Solution stop
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION Tableau 6
Réactifs Quantité Code Reconstitution
MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
Microplaque B-CIC-MP
12 x 8 • Pipettes de précision réglables avec pointes jetables
pré-coatée avec C1q Prête à l’emploi
puits
humain pour 20 µL, 100 µL et 1000 µL.
Films adhésifs 3 pièces • Tubes jetables en polypropylène ou polystyrène pour la
Tampon de Lavage B-CIC-WB A reconstituer
préparation des dilutions d’échantillons.
1 flacon
concentré (10x) avec 900 mL • Eprouvette graduée de 1000 mL pour la préparation du
100 mL d’eau déionisée
avec conservateurs tampon de lavage.
Tampon d’incubation 1 flacon B-CIC-IB • Laveur automatique de microplaques ou une pissette
Prêt à l’emploi
avec conservateurs 100 mL pour le tampon de lavage.
Calibrateurs A à E*) B-CIC-CASET • Papier absorbant.
5 flacons
agrégats d’IgG en tampon Prêts à l’emploi
avec conservateurs
1 mL • Agitateur de microplaques.
Contrôles bas et élevé**) B-CIC- • Lecteur de microplaques pour la mesure de
2 flacons
Agrégats d’IgG en tampon
CONSET Prêts à l’emploi l’absorbance à 405 nm.
1 mL
avec conservateurs
Marqueur enzymatique B-CIC-EL PRÉCAUTIONS
1 flacon
protéine A aPase-conjuguée Prêt à l’emploi Précautions de sécurité
dans un tampon protéique 11 mL
avec conservateurs • La microplaque (B-CIC-MP), les calibrateurs (B-CIC-
Substrat pNPP 1 flacon B-PNPP CASET) et les contrôles (B-CIC-CONSET) de cette
avec granules stabilisants Prêt à l’emploi trousse contiennent des composants d’origine humaine.
11 mL
Bien que les tests de détection de l’antigène de surface
Solution stop 1 flacon B-NAOH Prête à l’emploi du VHB et des anticorps des virus VHC et VIH1/2 se
hydroxyde de sodium 1 N 11 mL Corrosif
soient révélés négatifs, il convient de considérer les
Tableau 5 réactifs comme capables de transmettre des maladies
*) Les calibrateurs A, B, C, D et E contiennent respectivement 50, 20,
infectieuses, et de les manipuler conformément aux
10, 4 et 1 µg d’Equivalent d’agrégats IgG par mL (µg Eq/mL).
**) Les contrôles contiennent des quantités spécifiques à chaque lot bonnes pratiques de laboratoire, en prenant les
d’équivalents d’IgG agrégés par ml (µg Eq/mL). Pour les précautions appropriées.
concentration exactes, il convient de se référer aux limites de
confiance communiquées avec chaque lot de production.
• Substrat et solution stop : Eviter par conséquent, tout
contact avec les yeux, la peau et les habits et porter des
habits, des gants et des lunettes de protection adaptés.
En cas de contact avec les yeux ou la peau,
immédiatement laver abondamment avec de l’eau.
• Les solutions non-utilisées doivent être disposées
conformément aux réglementations local et nationales.
Release date: 2019-03-27 9/24 BÜHLMANN CIC-C1QPrécautions techniques 5. Couvrir la microplaque à l’aide d’un film adhésif fourni et
• Les composants ne doivent pas être utilisés au-delà de incuber avec agitation à 400-600 rpm et 18-28°C
la date d'expiration imprimée sur les étiquettes. Ne pas pendant 1 heure (± 5 minutes).
mélanger des réactifs de lots différents. 6. Retirer et jeter le film adhésif. Vider puis laver chacun
• Éviter la contamination des réactifs. des puits avec trois fois ≥300 µL de tampon de lavage.
Vider les puits et les sécher en tapant fermement la
• Ne pas reutilizer les micropuits.
microplaque sur du papier absorbant.
• Lire intégralement le mode d’emploi avant de
7. Ajouter 100 µL de marqueur enzymatique dans chacun
commencer le test et respecter strictement toutes les
des puits.
instructions, pour obtenir des résultats fiables.
8. Recouvrir la microplaque d’un nouveau film adhésif et
• La solution de substrat pNPP est prête à l’emploi. Ne incuber avec agitation à 400-600 rpm et 18-28°C
pas agiter au vortex ni tenter d’homogénéiser les billes pendant 30 (± 5) minutes.
stabilisantes avant utilisation.
9. Retirer et jeter le film adhésif. Vider puis laver les puits
trois fois avec chacun ≥300 µL de tampon de lavage.
PRELEVEMENT, PREPARATION ET
Vider les puits et les sécher en tapant fermement la
CONSERVATION DES ECHANTILLONS
microplaque sur du papier absorbant.
Prélever le sang par ponction veineuse dans des tubes Important: Laisser le substrat pNPP atteindre une
prévus à cet effet en évitant l’hémolyse. Centrifuger température de 18-28°C.
pendant 15 minutes à 2000 x g et 2-8°C, à l'abri de la
10. Ajouter 100 µL de substrat pNPP dans chaque puits.
lumière, puis récupérer le sérum ou le plasma. La
procédure requiert environ 50 µL de sang par 11. Recouvrir la microplaque d’un nouveau film adhésif et
détermination en duplicata. incuber avec agitation à 400-600 rpm et 18-28°C
Les échantillons peuvent être conservés à 2-8°C durant 7 pendant 30 (± 5) minutes. Protéger la microplaque de la
jours. Pour de plus longues durées de conservation, les lumiére.
échantillons devraient être placés à –20°C. 12. Ajouter 100 µL de solution stop dans chaque puit.
Eliminer les bulles d’air à l’aide d’une pointe de pipette.
PROCEDURE Passer à l’étape 13 dans les 30 minutes suivantes.
13. Lire l’absorbance à 405 nm à l’aide d’un lecteur de
Important: Porter les réactifs à 18-28°C avant utilisation.
microplaques.
1. Diluer au 1:50 tous les échantillons avec le tampon
d’incubation (par ex., 20 µL de sérum ou de plasma +
980 µL de tampon d’Incubation) et bien homogénéiser. CONTROLE QUALITE
Laisser reposer les échantillons dilués durant 15 Une lecture exhaustive de ce manuel est recommandée
minutes à 18-28°C avant le pipettage de l’étape 4c. pour l’utilisation correcte de ce produit. Des résultats
2. Préparer une microplaque avec suffisamment de puits fiables ne seront obtenus que par un travail en laboratoire
pour recevoir tous les calibrateurs, contrôles et précis (bonnes pratiques de laboratoire usuelles) et en
échantillons voulus. Retirer les barrettes en trop du suivant fidèlement les recommandations de cette brochure.
support et les placer immédiatement au froid dans la Comme il n’existe pas de sérum de référence pour les CIC
pochette prévue à cet effet contenant le dessiccateur. commercialement disponible, nous recommandons
3. Laver deux fois chaque puit avec au moins 300 µL de l’utilisation d’un pool de sérums positifs comme référence
tampon de lavage. Vider les puits et taper fermement la de contrôle qualité interne.
microplaque sur du papier absorbant afin de sécher les Tous les contrôles doivent avoir une valeur comprise entre
puits. les limites de confiance établies. Les limites de confiance
des contrôles sont spécifiques à chaque lot et sont
4a. Distribuer 100 µL de tampon d’incubation en double
indiquées sur la feuille de contrôle contenue dans chaque
dans les puits A1 et A2.
trousse.
Distribuer 100 µL de calibrateur A en double dans les La reproductibilité des paramètres de la courbe
puits B1 et B2. d’étalonnage ainsi que des valeurs des contrôles devraient
Distribuer 100 µL de calibrateur B en double dans les être comprises dans le domaine des valeurs attendues
puits C1 et C2. établies par chaque laboratoire. Si les caractéristiques de
Distribuer 100 µL de calibrateur C en double dans les performance ne correspond pas aux limites établies et que
puits D1 et D2. les répétitions excluent toute erreur technique, il est
Distribuer 100 µL de calibrateur D en double dans les recommandé de contrôler les paramètres suivants: i)
puits E1 et E2. pipetage, appareils de contrôle de température et de
Distribuer 100 µL de calibrateur E en double dans les temps, ii) calibrage des instruments, iii) date de péremption
puits F1 et F2. des réactifs, iv) conditions de stockage et d’incubation, v) le
4b. Distribuer 100 µL de contrôle bas en double dans les substrat pNPP devrait être incolore, vi) pureté de l’eau.
puits G1 et G2.
Distribuer 100 µL de contrôle élevé en double dans les
puits H1 et H2.
4c. Distribuer 100 µL de chaque échantillon dilué (1:50) en
double dans les puits suivants.
Release date: 2019-03-27 10/24 BÜHLMANN CIC-C1QRESULTATS ET CALCUL Standardisation: Les calibrateurs de la trousse
BÜHLMANN CIC-C1Q EIA ont été calibrés à l’aide de
Courbe d’étalonnage l’étalon de référence contenant des IgG humaines
• Mesurer l’absorbance à 405 nm pour chaque calibrateur agrégées, qui a été établi sous les auspices de l'OMS
et chaque blanc. (Section Genève).
• Calculer la moyenne des deux valeurs obtenues, Sensibilité:
soustraire la moyenne des blancs et relever les valeurs Limit of Blank (LoB) : 0.58 µg Eq/mL. Vingt doubles du
d’absorption moyenne corrigée. tampon d’incubation (blancs) ont été mesurés au cours
• Reporter l’absorbance (axe vertical) contre la d’un seul et même essai. La moyenne et la déviation
concentration en CIC (µg Eq/mL) des calibrateurs (axe standard (SD) de l’absorbance ont été calculées. La
horizontal) sur un quadrillage logarithmique (log/log). quantité minimale détectable de CIC obtenue est égale à
0.58 µg Eq/mL en ajoutant deux déviations standards à
• Tracer la courbe d’étalonnage ou la calculer au moyen
l’absorbance moyenne du blanc (tampon d’incubation) et
d’un algorithme de régression («spline smoothed fitting
en lisant la concentration de CIC correspondante à l’aide
algorithm»).
de la courbe d’étalonnage établie lors du même essai.
Echantillons et contrôles Limit of Quantification (LoQ) : moyenne + 3 SD) ont été éliminées des
calculée à partir des mesures de 20 doubles de chaque mesures des 192 donneurs normaux apparemment en
échantillon au cours d’un seul et même essai bonne santé en trois cycles itératifs. Une valeur seuil
(voir tableau 12); les valeurs sont données en µg Eq/mL). théorique (moyenne + 2 SD) de 3.2 µg Eq/mL a été
Précision inter-essai: 11.3%. La précision inter-essai a définie.
été calculée à partir des résultats de 3 doubles de chaque Cas limites et positifs : Pour des raisons pratiques, nous
échantillon au cours de 20 essais différents recommandons de considérer les valeurs entre 3.2 et 5.0
(voir tableau 13; les valeurs sont données en µg Eq/mL). µg Eq/mL comme des cas limites (zone d’incertitude).
Linéarité/Parallélisme de dilution: 104.8%. Des Les valeurs supérieures à 5.0 µg Eq/mL devraient être
échantillons sériques humains contenant des titres bas et considérées comme étant positives.
élevés de CIC ont été dilués dans du tampon d’incubation
puis mesurés selon la procédure standard (voir tableau 14; Limitations générales des titres normaux de CIC : des
les valeurs sont données en µg Eq/mL). valeurs élevées de CIC chez des donneurs normaux
peuvent apparaître dans environ 10 % des cas sans
Comparaison plasma/sérum: Des échantillons de sérum aucune manifestation clinique (vrais négatifs au-delà de la
et de plasma provenant de mêmes donneurs (n=47) ont limite normale) (réf. 7, 8). Cette observation est en accord
été dilués au 1:50 dans le tampon d’incubation et analysés avec nos résultats : 6 (3.1%) parmi 192 échantillons de
selon le protocole expérimental. Tous les échantillons de donneurs normaux ont été testés positifs avec le test CIC
sérum négatifs (n=27) ou se trouvant dans la zone grise ELISA et 14 (7.3%) se trouvaient dans la zone
(n=10) sont respectivement négatifs et dans la zone grise d’incertitude.
pour le plasma. Des résultats identiques sont obtenus pour
l’héparine plasma. La corrélation entre des mesures d’
échantillons positifs de sérum et de plasma de mêmes
donneurs (n=10) est très élevée (r=0.978). La mesure de
CIC peut ainsi être effectuée dans le sérum ou le plasma.
Release date: 2019-03-27 11/24 BÜHLMANN CIC-C1QLIMITES DU TEST • Interferences : Les échantillons lipémiques, hémolytiques et ictériques ne devraient pas être utilisés pour ce dosage. Les échantillons lipémiques peuvent être évités en demandant aux patients de jeûner durant au moins 12 heures avant le prélèvement. • Application : Les réactifs de cette trousse ont été optimisés pour la mesure des immuno-complexes circulants du sérum ou du plasma humain. • Diagnostic : La quantité des immuno-complexes circulants devrait être utilisée comme donnée complémentaire mise à la disposition du médecin dans le cadre de l’établissement d’un diagnostic. • Résultats : Les valeurs obtenus par diverses méthodes de dosage, ne peuvent pas être comparées entre eux. • Effet Crochet : Aucun effet crochet (« Hook effect ») n’a été observé jusqu’à 50'000 µg Eq/mL. • Valeurs attendues : Ces valeurs ne sont données qu’à titre indicatif. Il est recommandé à chaque laboratoire de définir les valeurs normales pour sa propre population de patients. Release date: 2019-03-27 12/24 BÜHLMANN CIC-C1Q
ITALIANO
USO CONSERVAZIONE ED EMIVITA DEI REAGENTI
Il kit BÜHLMANN CIC-C1Q EIA è un dosaggio per la Reagenti non aperti
determinazione quantitativa diagnostica in vitro degli Conservare a 2-8°C ad esclusione dei calibratori e dei controlli che
immunocomplessi circolanti (CIC) nel siero e nel plasma di devono essere conservati a -20°C o a temperature inferiori. Non utilizzare il
kit dopo la data di scadenza.
pazienti affetti da varie patologie autoimmuni e da altre
patologie CIC-relazionate. (1-3). Reagenti aperti/ ricostituiti
Riporre le strip non utilizzate immediatamente
PRINCIPIO DEL DOSAGGIO nella confezione contenente essiccante e
Micropiastra
risigillare la busta. Conservare fino alla data di
Gli immunocomplessi circolanti provenienti da sieri o da scadenza a 2-8°C.
plasma di pazienti o calibratori e controlli sono incubati con il Tampone di lavaggio Conservare a 2-8°C fino alla data di scadenza
C1q umano adeso ai pozzetti della micropiastra. Dopo Calibratori Stabili a –20°C fino alla data di scadenza. Per
lavaggio, viene aggiunto il coniugato marcato (Proteina A) una conservazione inferiore a 3 mesi i calibratori
con fosfatasi alcalina (aPase), che si lega alla regione Fc Controlli ed i controlli possono essere conservati a 2-8°C.
delle IgG umane. Dopo un ulteriore lavaggio, viene Tampone di incubazione
dispensato il substrato enzimatico (para-nitrofenil-fosfato o Marcato enzimatico
pNPP) quindi viene aggiunta la soluzione stoppante. Conservare a 2-8°C fino alla data di scadenza.
Substrato di pNPP
(4-6). L’assorbanza viene letta a 405 nm.
Soluzione stoppante
Tabella 8
REAGENTI FORNITI E PREPARAZIONE
Reagenti Quantità Codice Ricostituzione MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
Micropiastra 12 x 8
Pozzetti
B-CIC-MP Pronta all’uso • Pipette di precisione con puntali monouso per 20 µL,
Precoattata con C1q umana
100 µL e 1000 µL.
Foglio sigillante 3 pezzi
• Provette monouso di polistirene o polipropilene per la
Tampone di lavaggio
1 flacone Diluire con preparazione delle diluizioni.
concentrato (10x) B-CIC-WB 900 ml di acqua
100 mL deionizzata • Cilindro da 1000 mL per la diluizione del tampone di
Con conservanti
lavaggio concentrato.
Tampone di incubazione 1 flacone
B-CIC-IB Pronto all’uso • Lavatore per micropiastra o bottiglia a spruzzo per il
Con conservanti 100 mL
tampone di lavaggio.
Calibratori A - E*)
5 flaconi B-CIC- • Carta blottante.
IgG-Aggregate in un tampone/ Pronti all’uso
1 mL CASET
matrice con conservanti • Rotatore per micropiastra.
Controllo basso / alto **)
• Lettore per micropiastra per la misurazione
2 flaconi B-CIC-
IgG-Aggregate in un tampone/ Pronti all’uso dell’assorbanza a 405 nm.
1 mL CONSET
matrice con conservanti
Marcato enzimatico
1 flacone Pronto all’uso
PRECAUZIONI
Proteina A coniugato alla B-CIC-EL
aPase in una matrice/tampone 11 mL
proteica con conservanti Precauzioni di sicurezza
Substrato di pNPP 1 flacone Pronto all’uso • La micropiastra (B-CIC-MP), il calibratore (B-CIC-
con granuli di stabilizzazione B-PNPP CASET) ed i controlli di questo kit (B-CIC-CONSET)
11 mL
contengono componenti di origine umana. Benché
Soluzione stoppante 1 flacone Pronto all’uso
B-NAOH testati e risultati negativi all’antigene di superficie HBV e
1 N idrossido di sodio 11 mL Agente corrosivo
agli anticorpi HCV e HIV1/2, i reagenti devono essere
Tabella 7 maneggiati come potenzialmente infettivi e secondo le
*)
I calibratori A ,B, C, D ed E contengono 50, 20, 10, 4 e 1 µg
buone pratiche di laboratorio utilizzando le dovute
rispettivamente di equivalenti delle IgG aggregate per ml (µg Eq/mL),.
**)
I controlli contengono quantitativi lotto specifici di equivalenti di IgG precauzioni.
aggregate per ml (µg Eq/mL). Fare riferimento al foglio di QC aggiunto • Substrato e soluzione stoppante: Evitare il contatto con
al kit per le concentrazioni esatte.
gli occhi, cute e indumenti. Indossare guanti, indumenti
ed occhiali protettivi. Dopo un contatto con occhi o cute,
sciacquare immediatamente con abbondante acqua.
• Soluzioni non utilizzate devono essere eliminate
seguendo le normi di legge attuali.
Precauzioni tecniche
• I componenti non devono essere utilizzati dopo la data
di scadenza stampata sulle etichette. Non mescolare
diversi lotti di reagenti.
• Evitare la contaminazione dei reagenti.
Release date: 2019-03-27 13/24 BÜHLMANN CIC-C1Q• Strip non riutilizzabili. tampone di lavaggio per pozzetto. Svuotare i pozzetti e
• È importante consultare le Istruzioni per l’uso prima di scuotere la piastra energicamente su carta blottante.
iniziare il test. Soltanto seguendo esattamente le 7. Dispensare 100 µL di marcato enzimatico in tutti i
Istruzioni per l’uso si potranno ottenere risultati affidabili. pozzetti.
• La soluzione di substrato pNPP è pronta per l'uso. Non 8. Coprire la piastra con un foglio sigillante, collocare la
utilizzare il vortex né cercare di omogeneizzare le piastra su un rotatore settato a 400-600 rpm ed
palline stabilizzatrici prima dell'uso. incubare per 30 ± 5 minuti a 18-28°C.
9. Rimuovere ed eliminare il foglio sigillante. Svuotare i
PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI pozzetti e lavare tre volte utilizzando almeno 300 µL di
tampone di lavaggio per pozzetto. Svuotare i pozzetti e
La procedura richiede 50 µL di sangue per determinazioni scuotere la piastra energicamente su carta blottante.
in duplicato. Prelevare il sangue in provette semplici,
Importante: Fare in modo che il substrato di pNPP
evitando l’emolisi, mescolare capovolgendo la provetta
raggiunga 18-28°C.
diverse volte e lasciar coagulare 45 minuti a temperatura
ambiente (18-28°C) proteggere dalla luce. Centrifugare a 10. Dispensare 100 µL del substrato di pNPP a tutti i
1800 x g per 15 minuti a temperatura ambiente (18-28°C) e pozzetti.
prelevare il siero. 11. Coprire la piastra con un foglio sigillante, collocare la
I campioni possono essere conservati a 2-8 °C fino a 7 piastra su un rotatore settato a 400-600 rpm, proteggere
giorni. Se i campioni devono essere conservati per periodi la piastra dalla luce diretta ed incubare per 30 ± 5 minuti
più lunghi, mantenerli a ≤–20°C. a 18-28 °C.
12. Dispensare 100 µL della soluzione stoppante a tutti i
PROCEDURA DEL DOSAGGIO pozzetti. Rimuovere le bolle d’aria con una pipetta.
Importante: Fare in modo che i reagenti raggiungano Procedere con il punto 13 entro 30 minuti.
18-28°C prima dell’uso. 13. Leggere l’assorbanza a 405 nm in un lettore per
1. Diluire tutti i campioni 1:50 con tampone di incubazione micropiastre.
(e.g. 20 µL di siero o plasma + 980 µL di tampone di
incubazione) e mescolare bene. Fare in modo che i CONTROLLO QUALITA’
campioni diluiti riposino per 15 minuti a 18-28°C prima
È necessaria una comprensione completa di questa
di dispensare al punto 4c.
metodica per un utilizzo ottimale del prodotto. Solo
2. Preparare una micropiastra con strip sufficienti per utilizzando tecniche di laboratorio precise sarà possibile
testare il numero richiesto di calibratori, controlli e ottenere risultati affidabili (attuali linee guida GLP) e
campioni. Rimuovere le strip in eccesso dal supporto e seguendo con cura quanto indicato in questa metodica.
risigillarle immediatamente in una busta con essiccante. Poiché non esiste nessun siero di controllo per il CIC
Conservare refrigerata. disponibile in commercio, consigliamo l’utilizzo di un pool di
3. Lavare i pozzetti coattati due volte utilizzando almeno sieri positivi per i controlli di qualità interni.
300 µL di tampone di lavaggio per pozzetto. Vuotare i Tutti i controlli devono rientrare entro limiti di confidenza
pozzetti e scuotere la piastra energicamente su carta stabiliti. I limiti di confidenza per i controlli sono lotto
blottante. specifici e stampati sul foglio dati aggiuntivo.
4a. Dispensare 100 µL di tampone di incubazione in La riproducibilità dei parametri della curva standard e dei
duplicato nei pozzetti A1+A2 valori dei controlli deve essere entro limiti stabiliti di
accettabilità. Se caratteristiche del dosaggio non correla
Dispensare 100 µL del calibratore A in duplicato nei
con i limiti stabiliti e la ripetizione esclude errori nella
pozzetti B1+B2.
tecnica, verificare quanto segue: i) dispensazione, controllo
Dispensare 100 µL del calibratore B in duplicato nei
della temperatura e del tempo; ii) settaggi del lettore
pozzetti C1+C2.
ELISA; iii) data di scadenza dei reagenti; iv) conservazione
Dispensare 100 µL del calibratore C in duplicato nei
ed incubazione; v) il substrato di pNPP deve essere
pozzetti D1+D2.
incolore; vi) purezza dell’acqua.
Dispensare 100 µL del calibratore D in duplicato nei
pozzetti E1+E2.
Dispensare 100 µL del calibratore E in duplicato nei CALCOLO DEI RISULTATI
pozzetti F1+F2.
4b. Dispensare 100 µL del controllo basso in duplicato nei Curva Standard
pozzetti G1+G2. • Annotare l’assorbanza a 405 nm per ciascun calibratore
Dispensare 100 µL del controllo alto in duplicato nei e pozzetto bianco.
pozzetti H1+H2. • Effettuare la media dei valori in duplicato, sottrarre la
4c. Dispensare 100 µL di ciascuno dei campioni diluiti media dei pozzetti bianchi ed annotare le medie
(1:50) in duplicato nei pozzetti successivi. (= assorbenza media corretta).
5. Coprire la piastra con un foglio sigillante, collocare la • Plottare l’assorbanza (asse verticale) verso la
piastra su un rotatore settato a 400-600 rpm ed concentrazione CIC in µg Eq/mL dei calibratori (asse
incubare per 1 ora ± 5 minuti a 18-28°C. orizzontale) utilizzando carta per grafici log/log.
6. Rimuovere ed eliminare il foglio sigillante. Svuotare i • Disegnare la migliore curva o calcolare la curva
pozzetti e lavare tre volte utilizzando almeno 300 µL di standard utilizzando un algoritmo a quattro parametri.
Release date: 2019-03-27 14/24 BÜHLMANN CIC-C1QCampioni e controlli Comparazione di metodi: Una comparazione di campioni
• Annotare l’assorbanza a 405 nm per ciascun campione (n=64) di questo dosaggio ed un altro metodo approvato
e pozzetto dei controlli. dall’FDA hanno presentato la seguente correlazione:
Sensibilità relativa 24/25 = 96%
• Calcolare la media dei valori in duplicato, sottrarre la
Specificità relativa 38/39 = 97.4%
media dei pozzetti bianchi ed annotare le medie
Accuratezza relativa 62/64 = 96.9%
(=assorbenza media corretta).
• Localizzare il valore di assorbanza corretto del
campione sull’asse verticale, disegnare una linea
VALORI DI CUT-OFF ATTESI
orizzontale che interseca la curva standard e leggere la La frequenza del CIC nei sieri umani normali o nel plasma
concentrazione CIC (µg Eq/mL) dall’asse orizzontale. è stata determinata utilizzando campioni di sangue di
Vedi tabella 11 and figura 1 come esempio dei risultati e di donatori volontari (adulti uomini e donne di età compresa
curva standard. Questi risultati e le curve standard sono a tra 18 e 70 anni). 192 campioni sono stati dosati secondo
solo scopo dimostrativo. Occorre generare una curva procedura ed in risultati sono presentati in tabella 15,
standard per ciascun set di campioni da dosare. espressi in µg equivalente per ml (µg Eq/mL).
Cut-off proposto: Un totale di 10 valori molto elevati (>
CARATTERISTICHE DEL DOSAGGIO media + 3SD) dai risultati di 192 donatori sani
apparentemente normali sono stati eliminati in tre cicli
Precisione intradosaggio: 3.6%. E’ stata calcolata la iterativi. Ciò ha provocato un valore di cut-off teorico
precisione intradosaggio dai risultati di 20 coppie di valori (media + 2 SD) di 3.2 µg Eq/mL.
ottenuti in un unico dosaggio. I valori sono presentati in µg Borderline e positivi: Per ragioni pratiche consigliamo di
Eq/mL (tabella 12).
considerare i valori tra 3.2 e 5.0 µg Eq/mL come borderline
Precisione interdosaggio: 11.3%. La precisione (zona grigia).
interdosaggio è stata calcolata dai risultati di 3 coppie di
Valori superiori a 5.0 µg Eq/mL devono essere considerati
valori ottenute in 20 sedute diverse. I valori sono presentati
positivi.
in µg Eq/mL (tabella 13).
Limitazioni generali dei range normali CIC: sono noti
Linearità di diluizione/parallelismo: 104.8%. I campioni
range elevati di CIC nel 10% dei donatori di sangue normali
di siero umano contenenti livelli bassi ed elevati di CIC
senza manifestazioni cliniche. (veri negativi al di fuori del
sono stati diluiti con il tampone di incubazione e
range normale) (7, 8). Ciò è in linea con i nostri risultati: 6
successivamente dosati secondo procedura. I valori sono
(3.1 %) dove 192 campioni di donatori normali erano positivi
presentati in µg Eq/mL (tabella 14).
con il CIC ELISA e 14 (7.3 %) erano entro la zona grigia.
Comparazione plasma/siero: I campioni di plasma e di
siero umano di 47 donatori sono stati diluiti (1:50) con il
tampone di incubazione e successivamente dosati secondo LIMITI DEL TEST
procedura. Tutti i campioni di siero negativi (n=27) e • Interferenze: Non utilizzare campioni lipemici, emolitici
borderline (n=10) erano realmente negativi o bordeline se ed itterici. I campioni lipemici possono essere evitati
dosati con il plasma EDTA. Lo stesso si è verificato per il chiedendo ai pazienti di digiunare almeno 12 ore prima
plasma eparinizzato (n=20). Dieci campioni di siero positivi del prelievo.
hanno presentato una correlazione molto elevata (r=0.978)
• Applicazione: I reagenti forniti in questo kit sono
con i campioni di plasma dello stesso donatore. Quindi il
ottimizzati per misurare gli immunocomplessi circolanti
CIC può essere dosato sia su campioni di siero che di
nel siero o nel plasma umani.
plasma.
Standardizzazione: I calibratori del Kit BÜHLMANN CIC- • Interpretazione: Il quantitativo degli immunocomplessi
C1Q EIA sono stati calibrati verso la preparazione di in circolo deve essere utilizzato come dato aggiuntivo
riferimento delle IgG umane aggregate, che è stato per il medico nel determinare la diagnosi.
preparato sotto la auspicio della OMS (Sezione Ginevra). • Resultati: I valori ottenuti con dosaggi diversi non
possono essere comparati direttamente.
La dose minima rilevabile:
Limit of Blank (LoB): 0.58 μg Eq/mL. 20 duplicati del • Effetto gancio (Hook effect): Non è stato osservato
tampone di incubazione (reagente bianco) sono stati dosati nessun effetto gancio fino a 50'000 µg Eq/mL.
in un’unica seduta. Sono state calcolate la media e la • Valori di cut-off attesi: Il range di questi titoli devono
deviazione standard per i valori di assorbanza. La dose essere utilizzati solo come linee guida. Si consiglia ad
minima rilevabile dei camplessi CIC è stata calcolata in 0.58 ogni laboratorio di stabilire i propri range attesi.
µg Eq/mL aggiungendo due deviazioni standard
all’assorbanza media del bianco reagente (tampone di
incubazione) e intersecando questo valore con la curva
standard ottenuta nella stessa seduta.
Limit of Quantification (LoQ):You can also read
