BÜHLMANN fCAL - BÜHLMANN Laboratories AG
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BÜHLMANN fCAL®
ELISA
Calprotectin
EK-CAL 96 tests
EK-CAL2 192 tests
Revision date: 2018-04-10
BÜHLMANN Laboratories AG English page 3
Baselstrasse 55 Deutsch page 10
4124 Schönenbuch, Switzerland Français page 18
Tel.: +41 61 487 1212 Italiano page 26
Fax: +41 61 487 1234 Español page 34
info@buhlmannlabs.ch Português page 42Revision date: 2018-04-10 2/60 BÜHLMANN fCAL®ELISA
Quantity
Reagents Code Reconstitution
ENGLISH EK-CAL EK-CAL2
Control Low /
INTENDED USE High3) 2 vials 2 vials B-CAL-
Ready to use
Human serum x 1 mL x 1 mL CONSET
The BÜHLMANN fCAL®
ELISA is an in vitro diagnostic test with preservatives
for the quantitative determination of calprotectin in human
Enzyme Label
stool specimens intended as an aid to the assessment of Anti-calprotectin 1 vial 2 vials
intestinal mucosal inflammation. The assay results can be B-CAL-EL Ready to use
Ab conjugated to x 12 mL x 12 mL
used as an aid to diagnosis in distinguishing organic, HRP
inflammatory disease of the gastrointestinal tract TMB Substrate
1 vial 2 vials
(inflammatory bowel disease, IBD, e.g. Crohn’s disease or TMB in citrate B-TMB12 Ready to use
x 12 mL x 12 mL
ulcerative colitis, UC) from functional disease (irritable buffer
bowel syndrome, IBS) (ref. 1-7), in patients with chronic Stop Solution
1 vial 2 vials Ready to use
abdominal pain, above the age of four (ref. 8-9), and as an 0.25 M sulfuric x 12 mL
B-STS12
x 12 mL Corrosive agent
aid to IBD disease monitoring (ref. 10-20). acid
For laboratory use only. Table 1
1)
The actual calprotectin concentration of the standards A to E are 4, 12,
PRINCIPLE OF THE ASSAY 40, 120 and 240 ng/mL, respectively. For extraction and subsequent
sample dilution, a dilution of 1:2500 was taken into account for the
The BÜHLMANN fCAL® ELISA allows the selective assignment of calibrator A to E. For the lower range ELISA procedure
measurement of calprotectin in fecal extracts by sandwich the calibrator values have to be set as: 10, 30, 100, 300 and 600 µg/g
ELISA. The microtiter plate of the BÜHLMANN fCAL® calprotectin.
2)
If you choose the extended range ELISA procedure the nominal
ELISA is coated with a monoclonal capture antibody (mAb) calibrator values have to be set as: 30, 90, 300, 900 and 1800 µg/g
highly specific to the calprotectin heterodimeric and calprotectin.
polymeric complexes. Patient fecal sample extracts, 3)
The controls contain lot specific amounts of native human calprotectin.
controls for determination of ELISA run acceptability, and Refer to the additional QC data sheet for actual concentrations.
calibrators are loaded onto wells of the microtiter plate.
After a 30 minute incubation at room temperature and STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS
washing steps, a detection antibody (Ab) conjugated to
Unopened reagents
horseradish peroxidase (HRP) detects the calprotectin
Store at 2-8 °C. Do not use the reagents beyond the expiration date
molecules bound to the capture antibody on the plate. After
printed on the labels.
incubation and further washing steps, the chromogenic
Opened / Reconstituted reagents
HRP substrate, tetramethylbenzidine (TMB) is added (blue
color formation) followed by a stopping reaction (change to Extraction Buffer Store at 2-8 °C until expiration date.
yellow color). The absorption is measured at 450 nm. The Return unused strips immediately to the foil
final calprotectin concentration in µg/g stool in the patient pouch containing the desiccant packs and reseal
Microtiter Plate along the entire edge of zip-seal.
samples is determined using the calibration curve
Store until expiration date at 2-8 °C.
generated from the measured calibrator values.
Diluted Wash Buffer Store for up to 6 months at 2-8 °C.
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION Incubation Buffer
Quantity Calibrators
Reagents Code Reconstitution
EK-CAL EK-CAL2 Controls
Store at 2-8 °C until expiration date.
Extraction 3 bottles 6 bottles Enzyme Label
B-CAL-EX Ready to use
Buffer x 125 mL x 125 mL TMB Substrate
Microtiter Plate Stop Solution
precoated with 12 x 8 2 x 12 x 8
B-CAL-MP Ready to use Table 2
anti-calprotectin wells wells
mAb
Plate Sealer 3 pieces 6 pieces - Ready to use
Wash Buffer
1 bottle 2 bottles Dilute each with
Concentrate
B-CAL-WB 900 mL of
(10x) with x 100 mL x 100 mL deionized H2O
preservatives
Incubation
2 bottles 3 bottles
Buffer B-CAL-IB Ready to use
x 125 mL x 125 mL
with preservatives
Calibrators
A to E1) 2)
5 vials 5 vials B-CAL-
Calprotectin in a Ready to use
x 1 mL x 1 mL CASET
buffer matrix with
preservatives
Revision date: 2018-04-10 3/60 BÜHLMANN fCAL® ELISA• Stop solution: The stop solution (B-STS12) contains
REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED sulfuric acid (0.25 M). The reagent is an irritant to eyes,
SUPPLEMENTARY skin and mucous membranes. Avoid contact with eyes,
skin and clothes. After contact with eyes or skin, wash
Fecal extraction devices immediately with plenty of water.
Fecal extraction devices described in table 3 are not
delivered with the kit and either of them has to be ordered • Reagents: Avoid contact of reagents with the skin, eyes,
with the kit. or mucous membranes. If contact does occur,
immediately wash with generous amounts of water;
Extraction otherwise, irritation / burns can occur.
Quantity Code
Devices
Package with 50, 200 or 500
• Unused solution should be disposed of according to
®
B-CALEX-C50 local state and federal regulations.
CALEX Cap tubes respectively, each
B-CALEX-C200
Device filled with extraction buffer,
B-CALEX-C500 Technical precautions
5 mL / ready to use
50 tubes, spatulas, and base
Kit components
Smart-Prep B-CAL-RD
caps • Residues in the microtiter plate wells result from the
production process. They are removed in the washing
50 tubes consisting of tube, step (assay procedure step 3) and do not affect the
ScheBo® Quick- cone & dosing tip, B-CAL-SO50
PrepTM results.
1.3 mL / ready to use
• Read carefully the instructions prior to carrying out the
Table 3 test. Test performance will be adversely affected, if
reagents are incorrectly diluted, modified or stored under
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED conditions other than those as detailed in this instruction
Extraction procedure for use.
• 10 µL disposable inoculation loops • Components must not be used after the expiry date
printed on the labels.
• 15 mL polypropylene tubes with screw caps required for
standard extraction procedure; extraction devices (see • Do not mix different lots of reagents.
above). • Every effort should be made to ensure that no cross
• Laminar flow work station contamination occurs between reagents, samples or
between wells.
• Multi tube vortex mixer
• Allow the reagents to equilibrate to room temperature.
• Precision balance (10-150 mg) Mix well (vortex) the reagents before use.
• Micro centrifuge (≥3000 x g) • Microwells cannot be re-used.
• Centrifuge (≥500 x g)
Extraction
ELISA procedure • In order to receive reliable and quantitative results it is
• 10, 100 and 1000 µL precision pipettes with disposable important to homogenize the stool sample entirely in the
tips exctraction device. Contaminations at the top of the
• Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the extraction tube should be avoided. Insoluable
preparation of sample dilutions (undigested) components may still be present after
extraction.
• 1000 mL cylinder to dilute the wash buffer
• Microtiter plate washer (see Technical Precautions) or ELISA procedure
squeeze bottle for wash buffer • In the ELISA procedure the washing step is essential to
• Microtiter plate rotator (see Technical Precautions) guarantee reproducible results. A minimal incubation
time of the wash buffer in the wells of at least 20
• Blotting paper seconds must be ensured each time.
• Microtiter plate reader for measurement of absorbance • When using an automated washer, BÜHLMANN strongly
at 450 nm recommends using “plate mode” i.e. each process step
(dispense/aspiration) is performed on all of the strips
PRECAUTIONS sequentially, before proceeding to the next process step.
Safety precautions Thus, the minimal incubation time is guaranteed.
• The calibrators and controls of this test contain • The indicated number of washing cycles is mandatory to
components of human origin. Although tested and found ensure reproducible results.
negative for HBV surface antigen, HCV and HIV1/2 • Set the plate rotator (shaker) at 450 rpm (• To ensure a complete antigen/antibody interaction, the 6. Transfer the homogenate into a 2 mL Eppendorf tube
incubation time in step 5 must be at least 30 minutes. and centrifuge in a microcentrifuge for 5 minutes at
Moderately longer incubation time (up to 5 minutes ) has 3000 x g.
no influence on the final outcome. 7. Take the supernatant into a fresh, labeled tube and
• The enzyme label is inactivated by oxygen and is highly continue with the ELISA procedure.
sensitive to sodium azide, thimerosal, hypochlorous acid Extraction procedures using fecal extraction devices:
and aromatic chlorohydrocarbons often found in The extraction procedure is described and illustrated in the
laboratory water supplies. Therefore, use only deionized instruction for use delivered with the respective extraction
high quality water. device.
• A new standard curve must be generated each time the
1. CALEX® Cap Device (Code B-CALEX-C50 / B-CALEX-
assay is performed.
C200 / B-CALEX-C500): The extraction tubes are
• If the initial concentration of an unknown sample reads prefilled with extraction buffer.
above the concentration of the highest calibrator,
Important: After extraction, centrifuge the CALEX® Cap
calibrator E, the sample must be further diluted with
Device for 5 minutes at 500-3000 x g and continue with the
incubation buffer and assayed again according to the
assay procedure.
assay procedure. The resulting total dilution factor must
be taken into account for the calculation of results. 2. Fecal extraction device Roche (Code 10745804322) or
BÜHLMANN Smart-Prep (Code: B-CAL-RD).
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE 3. ScheBo® Quick-PrepTM (Code B-CAL-SO50): The
If the extraction devices are used, less than 1 g of native extraction tubes are prefilled with extraction buffer.
stool specimen is needed for the extraction procedure. Important: After extraction with BÜHLMANN Smart Prep
Stool specimens should be collected into plain tubes. and ScheBo® Quick-PrepTM, centrifuge the tubes for 5
Important: The specimen must be collected without any minutes at 3000 x g. Alternatively, transfer the homogenate
chemical or biological additions in the collection device. into a 2 mL Eppendorf tube and centrifuge it in a
microcentrifuge for 5 minutes at 3000 x g. Decant the
Specimen transport supernatant into a fresh, labeled tube and continue with the
Stool specimens should be received by the laboratory within assay procedure.
3 days of collection. The specimens may be transported at
room temperature (23 °C). WORKING RANGE
Specimen storage The assay can be performed according to the following
Received stool specimens should be stored at 2-8 °C and procedures; lower or extended range ELISA procedure.
extracted within 3 days. Which procedure is to be chosen depends on the expected
Extract storage calprotectin concentration of the samples. For samples up
Calprotectin in extracts obtained by the BÜHLMANN to 600 µg/g choose the lower range procedure (working
CALEX® Cap is stable at room temperature for 3 days, at 2- range 10-600 µg/g). If the samples tend to exceed 600 µg/g
8 °C for 6 days and at -20 °C for 18 months. choose the extended range procedure (working range 30-
Calprotectin in extracts obtained by manual weighing 1800 µg/g).
method, by BÜHLMANN Smart-Prep or by ScheBo® Quick-
Prep™ is stable at 2-8 °C for 6 days or at -20 °C for 18
months.
STOOL SAMPLE EXTRACTION
Standard extraction procedure
1. Label and weigh (tare) the empty polypropylene tube
together with the inoculation loop.
2. Take out 50 to 100 mg of the stool sample by means of
the inoculation loop and place it into the pre-weighted
tube.
3. Calculate the net amount of sample, break off the
inoculation loop and leave the lower part of the loop in
the tube.
4. Add extraction buffer according to the formula
x mg stool x 49 = y µL extraction buffer (e.g. 50 mg stool
+ 2450 µL buffer) to the tube and close the tube.
5. Homogenize the sample on a multi tube vortexer by
vigorous shaking (at highest speed) for 30 minutes.
Revision date: 2018-04-10 5/60 BÜHLMANN fCAL® ELISAASSAY PROCEDURE 2. Prepare a plate with sufficient strips to test the required
number of calibrators, controls and diluted samples.
Important: Allow the reagents to equilibrate to 18-28 °C Remove excess strips from the holder and re-seal them
prior to use. Only dilute stool extracts. Standards and in the foil pouch together with the desiccant packs
controls are ready to use. without delay. Store refrigerated.
1. Sample dilution option 1: 3. Wash the coated wells twice using at least 300 µL of
Working range 10-600 µg/g wash buffer per well. Empty the wells and tap the plate
1.1. Manual weighing procedure, Smart Prep, or ScheBo® firmly onto blotting paper.
Quick-PrepTM: Dilute the stool extracts 1:50 with
Important: For every of the three wash steps a minimal
incubation buffer (e.g. 20 µL extract and 980 µL
incubation buffer) and mix well. Let the samples incubation time of at least 20 seconds of the wash buffer in
equilibrate for at least 5 minutes at 18-28 °C prior to the wells must be ensured (see technical precautions –
proceeding to step 4c. ELISA procedure).
1.2. CALEX® Cap device: Dilute the stool extracts 1:5 with
incubation buffer (e.g. 100 µL extract and 400 µL
incubation buffer) and mix well. Let the samples
equilibrate for at least 5 minutes at 18-28 °C prior to
proceeding to step 4c.
4a. Pipet 100 µL of incubation buffer (blank) and
Pipet 100 µL of Calibrator A-E into the respective wells.
4b. Pipet 100 µL of the controls low and high into the
respective wells.
1.` Sample dilution option 2:
Working range 30-1800 µg/g 4c. Pipet 100 µL of each diluted sample into the subsequent
The working range can be extended by a factor of 3, if you wells.
dilute the samples 1:7500 instead of 1:2500. This procedure 5. Cover the plate with a plate sealer, and incubate for
is recommended, if high calprotectin concentrations are to 30 + max. 5 min on a plate rotator set at 450 rpm at
be expected. The precision, linearity and analytical 18-28 °C (see Technical Precautions – ELISA
sensitivity of the extended range ELISA have been Procedure).
validated. The results of the validation (please refer to the
6. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells
performance characteristics section) support the extension
and wash three times using at least 300 µL of wash
of the measuring range to 30-1800 µg/g.
buffer per well (see Technical Precautions – ELISA
1.1` Manual weighing procedure, Smart Prep, or ScheBo® Procedure). Empty the wells and tap the plate firmly onto
Quick PrepTM: Dilute the stool extracts 1:150 with blotting paper.
incubation buffer (e.g. 20 µL extract and 2980 µL
incubation buffer) and mix well. Let the samples
equilibrate for at least 5 minutes at 18-28 °C prior to
proceeding to step 4c.
1.2` CALEX® Cap device: Dilute the stool extracts 1:15 with
incubation buffer (e.g. 50 µL extract and 700 µL
incubation buffer) and mix well. Let the samples
equilibrate for at least 5 minutes at 18-28 °C prior to
proceeding to step 4c.
Revision date: 2018-04-10 6/60 BÜHLMANN fCAL® ELISA7. Pipet 100 µL of enzyme label to each well. QUALITY CONTROL
8. Cover the plate with a plate sealer, and incubate for 30
Thorough understanding of this instruction is necessary for
±5 min on a plate rotator set at 450 rpm at 18-28 °C. the successful use of the product. Reliable results will be
9. Remove and discard the plate sealer. Empty the wells obtained only by precise laboratory techniques (current
and wash five times using at least 300 µL of wash buffer GLP guidelines) and accurately following this instruction for
per well. Empty the wells and tap the plate firmly onto use.
blotting paper. Since there is no control for calprotectin commercially
available, we recommend using a pool of positive stool
extracts for internal quality control.
The reproducibility of standard curve parameters and
control values should be within established limits of
laboratory acceptability. The confidence limits for the
controls are lot-specific and printed on the additional QC
data sheet.
If the performance of the assay does not meet the
established limits and repetition has excluded errors in
technique, check the following issues: i) pipetting,
Important: Allow the TMB substrate solution to equilibrate to temperature controlling and timing ii) ELISA reader settings
18-28 °C. iii) expiration dates of reagents iv) storage and incubation
conditions v) TMB substrate solution should be colorless vi)
10. Pipet 100 µL of the TMB substrate solution to all wells.
purity of water.
11. Cover the plate with a plate sealer, protect the plate from
direct light and incubate for 15 ±2 min on a plate rotator STANDARDIZATION
set at 450 rpm at 18-28 °C.
The BÜHLMANN fCAL® ELISA calibrator values are
assigned in multiple measurement runs using internal
reference material based on human serum and the
BÜHLMANN fCAL® ELISA measurement procedure. The
calprotectin concentration of the internal reference material
was established using purified MRP8/14 from human
granulocytes as primary reference material.
RESULTS AND CALCULATION
Read the absorbance at 450 nm in a microplate reader for
12. Pipet 100 µL of stop solution to all wells. Remove air each calibrator, control and sample using a 4 PL fit with
bubbles with a pipette tip. Proceed to step 13 within 30 blank subtraction and have the concentration of the
min. samples calculated.
13. Read the absorbance at 450 nm in a microtiter plate Working range 10-600 µg/g
reader.
If you choose the lower range ELISA procedure, the
calibrator concentrations have to be set as: 10, 30, 100, 300
and 600 µg/g calprotectin. Additional dilution factors (if
using a different final dilution than 1:2500) have to be
multiplied with the results to obtain the final results.
Refer to table 7 and figure 1 for typical data (results and
standard curve). These results and standard curve are
provided for demonstration purposes only. A standard curve
must be generated for each set of samples to be assayed.
Working range 30-1800 µg/g
If you choose the extended range ELISA procedure, the
following nominal calibrator values have to be set as: 30,
90, 300, 900 and 1800 µg/g calprotectin. Additional dilution
factors (if using a different final dilution than 1:7500) have to
be multiplied with the results to obtain the final results.
Refer to table 9 and figure 5 for typical data (results and
standard curve). These results and standard curve are
provided for demonstration purposes only. A standard curve
must be generated for each set of samples to be assayed.
Revision date: 2018-04-10 7/60 BÜHLMANN fCAL® ELISALIMITATIONS The cut-off level suggested for adults (50 µg/g) can also be
used for children aged from 4 to 17 years regardless of sex
• Reagents delivered with the BÜHLMANN fCAL® ELISA (ref. 8-9).
kit are intended for the determination of calprotectin
levels in human stool samples only.
INTERPRETATION OF RESULTS
• Test results should be interpreted in conjunction with
information available from clinical assessment of the IBD MONITORING
patient and other diagnostic procedures. The determination of fecal calprotectin is also a reliable and
• For IBD disease monitoring, multiple fecal calprotectin simple way to assist the monitoring of IBD patients (ref. 10-
measurements performed at up to 4 weeks intervals 20).
have been suggested to have best diagnostic accuracy Correlation of calprotectin levels and the inflammatory
in predicting clinical relapse in patients (ref. 21-22). status of patient’s intestinal mucosa, according to
• Patients who are taking NSAIDs regularly may have endoscopic evaluations, were determined in three
elevations in their fecal calprotectin levels. independent studies using BÜHLMANN calprotectin tests
(table 5). The diagnostic value of calprotectin in predicting
INTERPRETATION OF RESULTS clinical remission and relapse, according to patient`s
symptoms, clinical activity indices, unplanned need for
DISTINGUISHING ORGANIC DISEASE FROM therapy escalation, hospitalization or emergency was
FUNCTIONAL GASTROINTESTINAL DISEASE determined in three studies using BÜHLMANN calprotectin
tests (table 6).
Determination of fecal calprotectin is a reliable and easy
Condensed knowledge of published cut-offs and the above
way to distinguish organic from functional gastrointestinal
clinical performance studies support the following result
diseases (ref. 1-7).
categories:
The following data were established with the BÜHLMANN
fCAL® ELISA (order code: EK-CAL). In a clinical study, fecal Values below 100 µg/g:
calprotectin values of 344 symptomatic patients were Fecal calprotectin levels below 100 µg/g can reliably
compared with endoscopic findings. Endoscopy indicate patients, with low risk of clinical relapse, in
examination showed 264 patients with functional diseases endoscopic remission for whom invasive endoscopic
whereas 80 patients had various organic diseases (colitis, procedures can be avoided (ref. 10-20).
Crohn’s, ulcers, diverticulitis, polyps, adenomas, cancer, or
infectious diseases) (ref. 5). Values between 100-300 µg/g:
ROC curve analysis (AUC: 0.962) resulted in an optimal Fecal calprotectin levels between 100-300 µg/g may
clinical cut-off at 50 µg/g. Applying this cut-off, a clinical indicate the necessity of tighter control in the following
sensitivity and specificity of 88.8 % and 93.6 %, respectively period to assess disease development tendencies.
can be reached in the differentiation between organic and Values above 300 µg/g:
functional diseases (refer to table 4).
Fecal calprotectin levels above 300 µg/g should be
Fecal calprotectin levels from adults and children are
repeated and, if raised levels are confirmed, prompt further
comparable, whereas levels of newborns can be
investigative procedures (ref. 10-20).
significantly increased (ref. 8-9).
These data support the following recommendation for The above result categories are recommendations. It is
interpretation of results: advised that healthcare practitioners establish individual
patient thresholds by determining the patient’s baseline
Values below 50 µg/g:
calprotectin level during disease remission.
Calprotectin values below 50 µg/g are not indicative of
inflammation in the gastrointestinal tract. Patients with low A false negative result that is a calprotectin result below
calprotectin levels are likely not to be in need of invasive 100 µg/g category that should show a value above
procedures to determine the inflammation cause (ref. 5). 300 µg/g, for a patient with endoscopic inflammation,
although unlikely, may delay appropriate clinical decisions
Elevated values between 50 and 200 µg/g: and patient treatment. Therefore, it is important that the
Calprotectin values between 50 and 200 µg/g can represent patient remains under the care of a healthcare practitioner
mild organic disease such as inflammation caused by and reports any clinical symptoms.
NSAIDs, mild diverticulitis and IBD in remission phase. The Studies have shown that high calprotectin levels, above
low inflammatory response shown within this range may 300 µg/g, will not always indicate development of a clinical
suggest repeating the measurement and performing further relapse (ref. 10-20). High calprotectin levels should be
investigations. treated as a red flag signal and repeated. Confirmation of
Elevated values above 200 µg/g: raised levels should prompt further investigative
procedures.
Calprotectin values above 200 µg/g are indicative of active
organic disease with inflammation in the gastrointestinal
tract. Appropriate further investigative procedures by
specialists are suggested.
Revision date: 2018-04-10 8/60 BÜHLMANN fCAL® ELISAPERFORMANCE CHARACTERISTICS Inter-assay precision: 7.8-12.8 % CV
Working range: 10-600 µg/g The inter-assay precision of the ELISA was calculated from
Repeatability: 1.8-5.9 % CV five extracted stool samples. The aliquots were tested
Within-laboratory precision: 5.3 %-10.0 % CV according to the assay procedure in ten different runs by
three technicians using two kit lots in two different labs. The
Repeatability and within-laboratory precision was values are presented in table 11.
determined according to the CLSI approved guideline EP5-
A2. Nine extracted stool samples were tested in duplicate Limit of Blank (LoB):Menge
DEUTSCH Reagenz Code Rekonstitution
EK-CAL EK-CAL2
Waschpufferk Jede mit
ANWENDUNGSZWECK onzentrat 10x 1 Flasche 2 Flaschen 900 mL
B-CAL-WB
Der BÜHLMANN fCAL® ELISA ist ein in vitro Diagnosetest, Konservierungs x 100 mL x 100 mL deionisier-tem
mittel H2O verdünnen
für die quantitative Bestimmung von Calprotectin in
humanen Stuhlproben und ist zur Unterstützung der Inkubations-
puffer 2 Flaschen 3 Flaschen
Beurteilung einer Entzündung der Darmschleimhaut B-CAL-IB Gebrauchsfertig
Konservierungs x 125 mL x 125 mL
vorgesehen. Die Testergebnisse können zur Unterstützung mittel
dienen bei der Diagnose zur Unterscheidung einer
Kalibratoren
organischen, entzündlichen Erkrankung des Magen-Darm- A-E1) 2)
Traktes (entzündliche Darmerkrankungen; z.B. Morbus Calprotectin in 5 Röhrchen 5 Röhrchen B-CAL-
Gebrauchsfertig
Crohn; oder Colitis ulcerosa) von einer funktionellen proteinhaltigem x 1 mL x 1 mL CASET
Erkrankung (Reizdarmsyndrom) (Ref. 1-7) bei Patienten mit Puffer; Konser-
chronischen Bauchschmerzen, die älter als vier Jahre sind vierungsmittel
(Ref. 8-9). Die Testergebnisse können auch zur Kontrolle tief /
hoch3)
Unterstützung bei der Überwachung entzündlicher
Humanserum 2 Röhrchen 2 Röhrchen B-CAL-
Darmerkrankungen (Ref. 10-20) verwendet werden. CONSET
Gebrauchsfertig
mit x 1 mL x 1 mL
Konservierungs
Nur für Laborzwecke. mittel
Enzymmarker
PRINZIP DER METHODE anti- 1 Röhrchen 2 Röhrchen
Calprotectin Ak B-CAL-EL Gebrauchsfertig
Der BÜHLMANN fCAL® ELISA ermöglicht die selektive x 12 mL x 12 mL
konjugiert mit
Messung von Calprotectin in Stuhlprobenextrakten mit dem HRP
Sandwich-ELISA. Die Mikrotiterplatte des BÜHLMANN TMB-Substrat
fCAL® ELISAs ist mit einem monoklonalen Citrat- 1 Röhrchen 2 Röhrchen
B-TMB12 Gebrauchsfertig
Fängerantikörper beschichtet, der hochspezifisch für die gepufferte x 12 mL x 12 mL
TMB-Lösung
heterodimeren und polymeren Calprotectinkomplexe ist.
Stuhlprobenextrakte von Patienten, Kontrollen zur Stopp-Lösung
1 Röhrchen 2 Röhrchen Gebrauchsfertig
Bestimmung der ELISA Messakzeptanz und Kalibratoren 0,25 M B-STS12
x 12 mL x 12 mL korrosiv
Schwefelsäure
werden in die Wells der Mikrotiterplatte geladen. Nach einer
30-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur und nach Tabelle 1
den Waschschritten bindet ein Detektionsantikörper, der an 1)
Die tatsächliche Konzentrationen der Kalibratoren A-E betragen 4, 12,
Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt ist, an die 40, 120 und 240 ng/mL Calprotectin. Für die Extraktion und die
Probenverdünnung wurde eine Gesamtverdünnung von 1:2500 bei den
Caplprotectinmoleküle, die wiederum an die
Konzentrationen der Kalibratoren A-E bereits berücksichtigt. Für die
Fängerantikörper auf der Platte gebunden sind. Nach der „Lower Range“ ELISA Variante Im unteren Bereich müssen die
Inkubation und weiteren Waschschritten wird das Kalibratorwerte wie folgt eingestellt werden: 10, 30, 100, 300 und
chromogene HRP-Substrat und Tetramethylbenzidin (TMB) 600 µg/g Calprotectin.
2)
Wenn Sie die „Extended Range“ ELISA Variante verwenden, müssen die
hinzugefügt (Bildung einer blauen Farbe); danach wird die
nominalen Kalibratorwerte wie folgt eingestellt werden: 30, 90, 300, 900
Reaktion gestoppt (Farbumschlag nach gelb). Die und 1800 µg/g Calprotectin.
Absorption wird bei 450 nm gemessen. Die endgültige 3)
Die Kontrollen enthalten Lot-abhängige Konzentrationen von nativem,
Calprotectinkonzentration in µg/g Stuhl in den humanem Calprotectin. Die genauen Konzentrationen werden auf dem
QC Datenblatt angegeben.
Patientenproben wird mithilfe der Kalibrierkurve ermittelt,
die anhand der gemessenen Kalibratorwerte erstellt worden
ist.
GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG
Menge
Reagenz Code Rekonstitution
EK-CAL EK-CAL2
Extraktions- 3 Flaschen 6 Flaschen
B-CAL-EX Gebrauchsfertig
puffer x 125 mL x 125 mL
Mikrotiter-
platte
2 x 12 x 8
Beschichtet mit 12 x 8 Wells Wells B-CAL-MP Gebrauchsfertig
anti-Calprotectin
mAk
Abdeckfolien 3 Sück 6 Stück - Gebrauchsfertig
Revision date: 2018-04-10 10/60 BÜHLMANN fCAL®ELISALAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN ELISA
Ungeöffnete Reagenzien • Präzisionspipetten mit Einwegspitzen für 10, 100 und
1000 µL
Bei 2-8 °C lagern. Zu verwenden bis zum Verfallsdatum, angegeben auf
der Packungsetikette. • Polystyrol oder Polypropylen Einwegröhrchen zur
Geöffnete / rekonstituierte Reagenzien Durchführung von Probenverdünnungen
Extraktionspuffer Bis zum Verfallsdatum bei 2-8 °C lagern. • 1000 mL Messkolben zur Verdünnung des
Ungebrauchte Streifen sofort in die mit Waschpufferkonzentrats
Mikrotiterplatte
Trockenmittel versetzte Packung zurücklegen. • Mikrotiterplattenwaschautomat oder Spritzflasche für
Packung gut verschliessen. Bei 2-8°C bis zum
Verfallsdatum haltbar. Waschpuffer (siehe technische Vorsichtsmassnahmen)
Bei 2-8 °C bis 6 Monate nach der Verdünnung • Mikrotiterplattenschüttler (siehe technische Vorsichts-
Waschpuffer
lagern. massnahmen)
Inkubationspuffer • Saugfähiges Papier
Kalibratoren • Mikrotiterplattenphotometer mit optischem Filter
Kontrollen (450 nm)
Bis zum Verfallsdatum bei 2-8 °C lagern.
Enzymmarker
TMB-Substrat VORSICHTSMASSNAHMEN
Stopp-Lösung Sicherheitsmassnahmen
Tabelle 2 • Die Kalibratoren und Kontrollen enthalten Bestandteile
humanen Ursprungs. Obwohl sie negativ in Tests für
REAGENZIEN UND MATERIAL ZUSÄTZLICH HBV Oberflächenantigen, HCV und HIV1/2 Antikörper
ERHÄLTLICH waren, sollten sie gemäss „guter Laborpraxis“ (GLP) als
potentiell infektiös behandelt werden und die
Extraktionsprodukte für Stuhlproben entsprechenden Sicherheits-vorkehrungen getroffen
Extraktionsprodukte zur Stuhlextraktion werden nicht mit werden.
diesem Kit mitgeliefert. Eines der in Tabelle 3 beschrieben • Stopp-Lösung: Die Stopp-Lösung (B-STS12) enthält
Produkte muss zusätzlich zum Kit bestellt werden. Schwefelsäure (0,25 M). Das Reagenz reizt die Augen,
Haut und Schleimhäute. Kontakt mit Augen, Haut und
Extraktionsprodukte Menge Code
Kleidung vermeiden. Bei Berührung mit den Augen oder
Packungen zu 50, 200 der Haut sofort mit viel Wasser abwaschen.
und 500 Röhrchen, B-CALEX-C50
CALEX® Cap gefüllt mit B-CALEX-C200 • Reagenzien: Kontakt der Reagenzien mit der Haut, den
Extraktionspuffer, B-CALEX-C500 Augen oder den Schleimhäuten vermeiden. Im Falle
5 mL / gebrauchsfertig
eines Kontaktes sofort mit reichlich Wasser spühlen,
Smart-Prep
50 Röhrchen, Spatel und
B-CAL-RD ansonsten kann eine Reizung oder Verätzungen
Böden auftreten.
50 Röhrchen bestehend • Ungebrauchte Lösungen sollten gemäss den lokalen
ScheBo® Quick- aus Röhrchen, Konus gesetzlichen Bestimmungen entsorgt werden.
B-CAL-SO50
PrepTM und Dosierspitze,
1,3 mL / gebrauchsfertig Technische Vorsichtsmassnahmen
Tabelle 3 Kit Komponenten
• Auf Grund des Produktionsprozesses kann es
ERFORDERLICHE NICHT IM LIEFERUMFANG Rückstände in den Wells der Mikrotiterplatten geben.
ENTHALTENE MATERIALIEN Sie werden mit dem 1. Waschen (Testdurchführung
Extraktion Schritt 3) entfernt und haben keinen Einfluss auf die
Ergebnisse.
• 10 µL Einwegimpfschlingen
• Lesen Sie vor der Testdurchführung die Arbeitsanleitung
• 15 mL Polypropylen Einwegröhrchen mit Schraubver-
sorgfältig durch. Die Testqualität kann negativ
schluss für die Standardextraktion
beeinflusst werden, wenn die Reagenzien nicht korrekt
• Laminar Flow Arbeitsplatz verdünnt oder verändert werden, sowie nicht
• „Multi Tube“ Vortex Mixer entsprechend der in dieser Anleitung angegebenen
• Präzisionswaage (10-150 mg) Lagerungsbedingungen gelagert werden.
• Mikrozentrifuge (≥3000 x g) • Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Verfallsdatums
nicht mehr verwendet werden.
• Zentrifuge (≥500 x g)
• Mischen Sie nicht Reagenzien verschiedener Lots.
• Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass es zu
Kontaminationen zwischen verschiedenen Reagenzien,
Proben und zwischen den Wells kommt.
Revision date: 2018-04-10 11/60 BÜHLMANN fCAL® ELISA• Die Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur PROBENGEWINNUNG UND LAGERUNG
äquilibrieren lassen und mischen (vortexen).
Wenn Extraktionsröhrchen für die Extraktion verwendet
• Mikrotiterstreifen dürfen nicht wiederverwendet werden. werden, werden weniger als 1 g native Stuhlprobe benötigt.
Extraktion Die Stuhlprobe muss in einem leeren Entnahmeröhrchen
• Um verlässliche, quantitative Resultate zu erhalten, ist gesammelt werden.
es wichtig, dass die im Extraktionsröhrchen enthaltene Wichtig: Die Stuhlproben dürfen nicht mit Röhrchen, die
Stuhlprobe vollständig homogenisiert wird. chemische oder biologische Zusätze enthalten, gesammelt
Kontaminationen am oberen Rand des Extraktions- werden.
röhrchens sollten vermieden werden. Unlösliche
Transport der Proben
(unverdaute) Bestandteile können auch nach der
Extraktion verhanden sein. Innerhalb von 3 Tagen nach Gewinnung des
Untersuchungsmaterials sollte es vom Labor erhalten
ELISA Prozedur werden. Die Proben können bei Raumtemperatur
• Die korrekte Durchführung der in der Arbeitsvorschrift transportiert werden (23 °C).
beschriebenen Waschschritte ist essentiell, um
Lagerung der Proben
reproduzierbare Resultate zu garantieren. Eine minimale
Inkubationszeit des Waschpuffers im Well von Erhaltene Stuhlproben sollten bei 2-8 °C gelagert und
mindestens 20 Sekunden muss bei jedem Waschschritt innerhalb von 3 Tagen extrahiert werden.
eingehalten werden. Lagerung des Extraktes
• Wird ein Waschautomat eingesetzt, muss der „Platten- Calprotectin in Extrakten, die mit BÜHLMANN CALEX® Cap
Modus“ gewählt werden. Das heisst, dass jeder Schritt gewonnen wurden, sind bei Raumtemperatur 3 Tage, bei 2-
(Einfüllen) erst über die gesamte Platte ausgeführt wird, 8 °C 6 Tage und bei -20 °C 18 Monate stabil.
bevor der nächste Schritt (Absaugen) gestartet wird. Calprotectin in Extrakten, die mit manuellen
Somit kann die minimale Inkubationszeit gewährleistet Wiegemethoden, wie BÜHLMANN Smart-Prep oder
werden. ScheBo® Quick-Prep™, gewonnen wurden, ist bei 2-8 °C 6
• Die angegebene Anzahl von Waschschritten muss Tage oder bei -20 °C 18 Monate stabil.
eingehalten werden, um reproduzierbare Resultate zu
gewährleisten. STUHLPROBENEXTRAKTION
• Der Mikrotiterplattenschüttler muss auf 450 rpm Standardextraktionsanleitung
(Extraktion unter Verwendung von 1.2 CALEX® Cap: Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer
Stuhlextraktionsröhrchen 1:5 verdünnen (z.B. 100 µL Extrakt + 400 µL
Inkubationspuffer). Nach der Verdünnung gut mischen
Die Extraktion ist in den Extraktionsröhrchen beiliegenden
und die Proben vor Gebrauch in Schritt 4c mindestens
Anleitungen beschrieben und illustriert.
5 Minuten bei 18-28 °C stehen lassen.
1. CALEX® Cap (Code: B-CALEX-C50 / B-CALEX-C200 /
B-CALEX-C500): Die Extraktionsröhrchen sind mit 5 mL
Extraktionspuffer gefüllt.
Wichtig: Nach der Extraktion werden die Extraktions-
röhrchen 5 Minuten bei 500-3000 x g zentrifugiert. Danach
mit der Testdurchführung fortfahren.
2. Fäkales Extraktionsbesteck Roche (Code:
10745804322) oder BÜHLMANN Smart-Prep (Code: B-
CAL-RD).
3. ScheBo® Quick-Prep™ (Code B-CAL-SO50): Die
Extraktionsröhrchen sind vorgefüllt mit Extraktionspuffer.
Wichtig: Nach der Extraktion mit Smart-Prep oder ScheBo® 1.` Option 2 für die Probenverdünnung:
Quick-Prep™ werden die Röhrchen 5 Minuten bei 3000 x g Messbereich 30–1800 µg/g
zentrifugiert. Alternativ wird das Homogenat in ein 2 mL Der Messbereich kann um einen Faktor von 3 erweitert
Eppendorf Röhrchen überführt und 5 Minuten bei 3000 x g werden, wenn die Proben 1:7500 statt 1:2500 verdünnt
in einer Mikrofuge zentrifugiert. Den Überstand in ein werden. Diese Testversion wird empfohlen, wenn hohe
frisches beschriftetes Röhrchen überführen und mit der Calprotectinkonzentrationen zu erwarten sind. Die
Testdurchführung fortfahren. Präzision, Linearität und analytische Empfindlichkeit des
„Extended Range“ ELISAs wurde validiert. Die Ergebnisse
MESSBEREICHE der Validierung (Siehe Abschnitt „Leistunbsmerkmale“)
unterstützen die Erweiterung des Messbereichs auf 30-
Der Test kann entweder nach der Anleitung für den unteren
1800 µg/g.
Konzentrationsbereich „Lower Range“ ELISA Variante oder
der Anleitung für den erweiterten Messbereich „Extended 1.1` Manuelle Einwaage, Smart Prep oder ScheBo® Quick
Range“ ELISA Variante durchgeführt werden. Welche Prep™: Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer 1:150
Version Sie wählen sollten, hängt von der erwarteten verdünnen (z.B. 20 µL Extrakt + 2980 µL Inkubations-
Calprotectinkonzentration der Proben ab. Für Proben bis zu puffer). Nach der Verdünnung gut mischen und die
600 µg/g sollte die Anleitung für den Messbereich 10- Proben vor Gebrauch in Schritt 4c für mindestens 5
600 µg/g verwendet werden. Wenn die Konzentration der Minuten bei 18-28 °C stehen lassen.
Proben jedoch häufig oberhalb von 600 µg/g liegt, raten wir 1.2` CALEX® Cap: Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer
zu der Anleitung für den erweiterten Messbereich 30- 1:15 (z.B. 50 µL Extrakt + 700 µL Inkubationspuffer).
1800 µg/g. Nach der Verdünnung gut mischen und die Proben vor
Gebrauch in Schritt 4c für mindestens 5 Minuten bei
TESTDURCHFÜHRUNG 18-28 °C stehen lassen.
Wichtig: Die Reagenzien sollten vor der Verwendung auf
eine Temperatur von 18-28 °C äquilibriert werden.
Nur die Stuhlextrakte verdünnen. Kalibratoren und
Kontrollen sind gebrauchsfertig.
1. Option 1 für die Probenverdünnung:
Messbereich 10-600 µg/g
1.1 Manuelle Einwaage, Smart Prep oder ScheBo® Quick
Prep™: Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer 1:50
verdünnen (z.B. 20 µL Extrakt + 980 µL Inkubations-
puffer). Nach der Verdünnung gut mischen und, vor
Gebrauch in Schritt 4c, die Proben für mindestens 5
Minuten bei 18-28 °C stehen lassen.
2. Eine Mikrotiterplatte mit ausreichender Menge an
Streifen für die Bestimmung von Kalibratoren, Kontrollen
und verdünnten Proben bestücken. Ungebrauchte
Streifen vom Halter entfernen und unverzüglich mit
Trockenmittel einpacken und gekühlt lagern.
Revision date: 2018-04-10 13/60 BÜHLMANN fCAL® ELISA3. Wells zweimal mit jeweils ≥300 µL Waschpuffer 7. 100 µL Enzymmarker zu allen Wells zugeben.
waschen. Waschpuffer ausschütten und Platte sorgfältig 8. Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf einem
auf saugfähigem Papier ausklopfen. Mikrotiterplattenschüttler bei 450 rpm 30 ±5 Min. bei 18-
Wichtig: Eine minimale Inkubationszeit des Waschpuffers 28 °C inkubieren.
im Well von 20 Sekunden muss bei allen drei 9. Abdeckfolie entsorgen, die Wells entleeren und 5 x mit
Waschschritten eingehalten werden (siehe technische jeweils mindestens 300 µL Waschpuffer waschen.
Vorsichtsmassnahmen - ELISA). Waschpuffer ausschütten und Platte sorgfältig auf
saugfähigem Papier ausklopfen.
Wichtig: TMB-Substrat vor dem Gebrauch auf 18-28° C
äquilibrieren lassen.
4a. 100 µL Inkubationspuffer (Blank) in das entsprechende
Well pipettieren. 10. 100 µL TMB-Substrat zu jedem Well zugeben.
Je 100 µL Kalibrator A-E in das entsprechende Well 11. Mikrotiterplatte zudecken und 15 ±2 Min. bei 18-28 °C
pipettieren. auf einem Mikrotiterplattenschüttler bei 450 rpm
inkubieren. Platte vor direktem Licht schützen.
4b. Je 100 µL Kontrolle tief und hoch in das entsprechende
Well pipettieren.
4c. Je 100 µL der verdünnten Proben in die nächsten Wells
pipettieren.
5. Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf einem
Mikrotiterplattenschüttler bei 450 rpm 30 + max. 5
Minuten bei 18-28 °C inkubieren (siehe technische
Vorsichtsmassnahmen - ELISA).
6. Abdeckfolie entfernen, die Wells entleeren und 3 x mit
jeweils mind. 300 µL Waschpuffer waschen (siehe
technische Vorsichtsmassnahmen - ELISA). 12. 100 µL Stopp-Lösung zu jedem Well zugeben und
Waschpuffer ausschütten und Platte sorgfältig auf vorhandene Luftbläschen mit Pipettenspitzen entfernen.
saugfähigem Papier ausklopfen. Innerhalb der nächsten 30 Minuten mit Schritt 13
fortfahren.
13. Optische Dichte in einem Mikrotiterplattenphotometer
bei 450 nm messen.
Revision date: 2018-04-10 14/60 BÜHLMANN fCAL® ELISAIn Tabelle 9 und Abbildung 5 sind Beispiele für Ergebnisse
QUALITÄTSKONTROLLE
und die Standardkurve angegeben. Diese Ergebnisse und
Ein vollständiges Verständnis dieser Anleitung ist für den die Standardkurve sind nur als Beispiel gedacht. Sie
erfolgreichen Einsatz des Produktes notwendig. müssen für jeden Ansatz eine Standardkurve ansetzen.
Zuverlässige Resultate werden nur durch die Anwendung
von GLP (aktuelle GLP Richtlinien) und die Einhaltung der LEISTUNGSEINSCHRÄNKUNGEN
Anleitung erreicht. • Die mit dem BÜHLMANN fCAL® ELISA Kit
Da es keine kommerziell erhältlichen Kontrollen für bereitgestellten Reagenzien sind nur für die Bestimmung
Calprotectin gibt, wird empfohlen, einen Pool von positiven der Calprotectinkonzentrationen in humanen
Stuhlextrakten als interne Qualitätskontrolle mitzuführen. Stuhlproben vorgesehen.
Alle Kontrollen müssen im angegebenen Vertrauensbereich
• Testergebnisse sollten in Verbindung mit in einer
liegen. Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind Lot-
klinischen Beurteilung des Patienten gewonnenen
spezifisch und sind auf dem Kit beiliegenden QC Datenblatt
Informationen und sonstigen Diagnoseverfahren
angegeben.
ausgewertet werden.
Falls die Ergebnisse des Testes nicht innerhalb der
erwarteten Bereiche liegen und wiederholte Messungen • Um bei der IBD-Überwachung die beste diagnostische
einen Durchführungsfehler ausschliessen, sind folgende Genauigkeit zu erreichen, einen klinischen Rückfall
Punkte zu überprüfen: i) Pipetten, Temperatur und vorherzusehen, wurde empfohlen, mehrere Messungen
Zeitmessung, ii) Photometer Eichung, iii) Verfallsdaten der des fäkalen Calprotectins in bis zu 4 Wochen Intervallen
Reagenzien, iv) Lagerung- und Inkubationsbedingungen, v) durchzuführen (Ref. 21-22).
das TMB-Substrat sollte farblos sein, vi) Wasserreinheit. • Patienten, die regelmäßig NSAIDs einnehmen, haben
möglicherweise erhöhte Calprotectinkonzentrationen im
STANDARDISIERUNG Stuhl.
Die BÜHLMANN fCAL® ELISA Kalibratorwerte werden in
mehrfachen Messdurchgängen mithilfe von internem INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Referenzmaterial zugewiesen, das auf Humanserum und UNTERSCHEIDEN EINER ORGANISCHEN
dem BÜHLMANN fCAL® ELISA Messverfahren basiert. Die ERKRANKUNG VON EINER FUNKTIONELLEN
Calprotectinkonzentration des internen Referenzmaterials
GASTROINTESTINALEN ERKRANKUNG
wurde mithilfe von gereinigtem MRP8/14 aus humanen
Granulozyten als primäres Referenzmaterial ermittelt. Die Bestimmung des Calprotectinspiegels in Stuhlproben
kann als zuverlässige und einfache Hilfe bei der
ERGEBNISSE UND BERECHNUNGEN Unterscheidung zwischen organischen und funktionellen
Messen Sie die Extinktion bei 450 nm in einem gastrointestinalen Erkrankungen verwendet werden (Ref. 1-
Mikrotiterplattenphotometer für Kalibratoren, Kontrollen und 7).
Proben unter Verwendung eines 4PL Auswertemodus und Die folgenden Daten wurden mit dem BÜHLMANN fCAL®
Leerwert- (Blank) abzug. ELISA erhoben (Bestellcode: EK-CAL). In einer klinischen
Studie wurden die Calprotectinwerte von 344
Messbereich 10-600 µg/g symptomatischen Patienten mit den Ergebnissen einer
Wenn Sie die “Lower Range“ ELISA Variante verwenden, endoskopischen Untersuchung verglichen.
müssen die Kalibratorkonzentrationen wie folgt eingestellt Die endoskopische Untersuchung zeigte bei 264 Patienten
werden: 10, 30, 100, 300 und 600 µg/g Calprotectin. eine funktionelle Erkrankung, während bei 80 Patienten
Zusätzliche Verdünnungsfaktoren (bei Verwendung einer unterschiedliche organische Erkrankungen festgestellt
anderen Verdünnung als 1:2500) müssen für den Erhalt der wurden (Kolitis, Crohn’s, Ulzera, Divertikulitis, Polypen,
endgültigen Ergebnisse mit den Ergebnissen multipliziert Adenome, Karzinome oder Infektionserkrankungen) (Ref.
werden. 5).
In der Tabelle 7 und Abbildung 1 werden Beispiele für Die ROC Analyse (AUC: 0,962) ergab einen optimalen
Ergebnisse und die Standardkurve gezeigt. Diese klinischen Grenzwert von 50 μg/g für die Differenzierung
Ergebnisse und die Standardkurve sind nur als Beispiel zwischen organischen und funktionellen Erkrankungen mit
gedacht. Sie müssen für jeden Ansatz eine Standardkurve einer klinischen Spezifität von 88,8 % und einer Sensitivität
ansetzen. von 93,6 % (Tabelle 4).
Calprotectinwerte von Erwachsenen und Kindern zwischen
Messbereich 30-1800 µg/g 4 und 17 Jahren sind vergleichbar, während die Werte von
Wenn Sie die „Extended Range“ ELISA Variante Neugeborenen signifikant höher sind (Ref. 8).
verwenden, müssen die folgenden nominalen Diese Daten stützen die folgenden Empfehlungen zur
Kalibratorwerte eingestellt werden: 30, 90, 300, 900 und Beurteilung der Ergebnisse:
1800 µg/g Calprotectin. Zusätzliche Verdünnungsfaktoren
(bei Verwendung einer anderen Verdünnung als 1:7500)
müssen für den Erhalt der endgültigen Ergebnisse mit den
Ergebnissen multipliziert werden.
Revision date: 2018-04-10 15/60 BÜHLMANN fCAL® ELISAWerte oberhalb von 300 µg/g:
Werte unter 50 µg/g:
Messungen von fäkalen Calprotectinkonzentrationen
Calprotectinwerte unter 50 µg/g schliessen eine Ent-
oberhalb von 300 µg/g sollten wiederholt werden. Falls die
zündung des gastrointestinalen Traktes weitgehend aus.
erhöhten Werte bestätigt werden, sollten unverzüglich
Patienten mit niedrigen Calprotectinkonzentrationen
weitere Untersuchungen erfolgen (Ref. 10-20).
benötigen vermutlich keine invasiven Untersuchungen, um
die Entzündungsursache zu bestimmen (Ref. 4). Die oben genannten Ergebniskategorien sind als
Empfehlungen zu betrachten. Es wird empfohlen, dass
Erhöhte Werte zwischen 50 und 200 µg/g:
Ärzte die Grenzwerte für den einzelnen Patienten festlegen,
Calprotectinwerte zwischen 50 und 200 µg/g können durch indem Sie den Ausgangswert für Calprotectin während der
eine milde Form der organischen Erkrankung wie z.B. eine Remission bestimmen. Ein falsch-negatives Resultat bei
durch NSAIDs verursachte Entzündung, eine milde Form einen Patienten mit einer endoskopisch nachweisbaren
der Divertikulitis und durch IBD in einer Remissionsphase Entzündung, das ein Calprotectinergebnis in der Kategorie
verursacht werden. Da eine geringe Entzündungsaktivität mit Werten unter 100 µg/g anzeigt, aber einen Wert
vorhanden ist, empfehlen sich eine Wiederholungs- oberhalb von 300 µg/g zeigen sollte, kann - obwohl
messung und weitere Untersuchungen. unwahrscheinlich - geeignete klinische Entscheidungen und
Erhöhte Werte oberhalb von 200 µg/g: die Behandlung des Patienten verzögern. Daher ist es
Calprotectinwerte oberhalb von 200 µg/g deuten auf eine wichtig, dass der Patient weiterhin von einem Arzt betreut
aktive Form einer organischen Erkrankung des gastro- wird und mögliche klinische Symptome meldet. Studien
intestinalen Traktes hin. Es werden entsprechende weitere haben gezeigt, dass hohe Calprotectinwerte, oberhalb von
Untersuchungen durch Spezialisten empfohlen. 300 µg/g, nicht immer auf die Entwicklung eines klinischen
Rückfalls hindeuten (Ref. 10-20). Hohe Calprotectinwerte
Der für Erwachsene empfohlene Cut-off Wert von 50 µg/g müssen als Warnsignal betrachtet und die Messung muss
kann auch für Kinder zwischen 4 und 17 Jahren verwendet wiederholt werden. Bei einer Bestätigung erhöhter Werte
werden, unabhängig von deren Geschlecht (Ref. 8-9). sind unverzüglich weitere Untersuchungen vorzunehmen.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE LEISTUNGSMERKMALE
IBD-ÜBERWACHUNG Messbereich: 10-600 µg/g
Recovery: 1,8-5,9 % CV
Die Bestimmung von fäkalem Calprotectin ist auch eine
Intra-Assay Präzision: 5,3 %-10,0 % CV
zuverlässige und einfache Methode, um die Überwachung
von IBD-Patienten zu unterstützen (Ref. 10-20). Wiederholbarkeit und Intra-Assay Präzision wurden gemäß
Die Korrelation der Calprotectinkonzentrationen und dem der CLSI Richtlinie EP5-A2 bestimmt. Neun extrahierte
Entzündungsstatus der Darmschleimhaut von Patienten mit Stuhlproben wurden entsprechend der Arbeitsanleitung
endoskopischen Bewertungen wurde in drei voneinander über einen Zeitraum von 20 Tagen in Duplikaten geprüft.
unabhängigen Studien mit den BÜHLMANN Calprotectin- Pro Tag wurde ein Testlauf durchgeführt. Die Werte sind in
tests (Tabelle 5) ermittelt. Tabelle 8 dargestellt.
Der diagnostische Wert von Calprotectin zur Vorhersage Limit of Blank (LoB):Funktionelle Empfindlichkeit:
Quantité
Réactifs Code Reconstitution
FRANCAIS EK-CAL EK-CAL2
Tampon
UTILISATION PREVUE d’incubation 2 flacons 3 flacons de
B-CAL-IB Prêt à l’emploi
Avec de125 mL 125 mL
Le test BÜHLMANN fCAL® ELISA est un test diagnostique conservateurs
in vitro de dosage quantitatif de la calprotectine dans les Calibrateurs A-
échantillons de selles humaines. Son but est d'aider à E1) 2)
Calprotectine 5 flacons de 5 flacons de B-CAL-
évaluer l'état inflammatoire de la muqueuse intestinale. Les 1 mL 1 mL CASET
Prêts à l’emploi
dans un tampon
résultats de l'essai peuvent contribuer, d'une part, au protéique avec
diagnostic permettant de distinguer – chez les patients de conservateurs
plus de quatre ans souffrant de douleurs abdominales Contrôles bas
chroniques (réf. 8-9) – une maladie inflammatoire du tractus et élevé3)
2 flacons 2 flacons de B-CAL-
gastro-intestinal de type organique (maladie inflammatoire Sérum humain Prêts à l’emploi
de1 mL 1 mL CONSET
avec
chronique de l’intestin MICI, par ex. maladie de Crohn ou conservateurs
recto-colite hémorragique, RCH) d'une maladie Marqueur
fonctionnelle (syndrome de l’intestin irritable, SII) (réf. 1-7) enzymatique
et, d'autre part, au suivi d’une MICI (réf. 10-20). Ac anti- 1 flacon 2 flacons de
B-CAL-EL Prêt à l’emploi
calprotectine de12 mL 12 mL
conjugué à la
Pour utilisation en laboratoire uniquement. HRP
Substrat TMB
PRINCIPE DU TEST Solution de 1 flacon 2 flacons de
B-TMB12 Prêt à l’emploi
TMB dans un de12 mL 12 mL
La trousse BÜHLMANN fCAL®
ELISA permet de mesurer tampon citrate
de façon sélective la calprotectine dans des extraits fécaux Solution stop 1 flacon 2 flacons de Prête à l’emploi
au moyen d'un dosage ELISA de type sandwich. La B-STS12
0.25 M H2SO4 de12 mL 12 mL corrosif
microplaque du test BÜHLMANN fCAL® ELISA est Tableau 1
recouverte à l'aide d'un anticorps de capture monoclonal 1)
Les concentrations actuelles de calprotectine des calibrateurs A à E sont
(Acm) hautement spécifique vis-à-vis des complexes respectivement : 4, 12, 40, 120 et 240 ng/mL. Après extraction et dilution
hétérodimères et polymères de calprotectine. On dépose de l’échantillon, une dilution à 1:2500 est prise en compte pour la
sur les puits de la microplaque les extraits d'échantillons détermination des calibrateurs A à E. Dans le cas de la procédure ELISA
fécaux du patient, les témoins permettant de déterminer sur la gamme la plus basse, les valeurs des calibrateurs doivent être les
suivantes : 10, 30, 100, 300 et 600 µg/g de calprotectine.
l'acceptabilité du dosage ELISA ainsi que des calibrateurs. 2)
Si l’utilisateur choisit la procédure ELISA sur la gamme étendue, les
À l'issue d'une incubation de 30 minutes à température valeurs nominales des calibrateurs doivent être les suivantes : 30, 90,
ambiante et d'étapes de lavage, un anticorps (Ac) de 300, 900 et 1 800 µg/g de calprotectine.
3)
détection conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) met en Les concentrations en calprotectine humaine native des contrôles varient
en fonction des lots. Veuillez-vous référer à la fiche de contrôle qualité
évidence les molécules de calprotectine liées à l'anticorps pour les concentrations effectives.
de capture sur la microplaque. Après l'incubation et d'autres
étapes de lavage, on ajoute le substrat chromogène de la
STOCKAGE ET DUREE DE CONSERVATION
HRP, la tétraméthylbenzidine (TMB) (formation d'une
DES REACTIFS
coloration bleue) puis une solution qui arrête la réaction (la
coloration vire au jaune). On mesure l'absorption à 450 nm. Réactifs non ouverts/ non entamés
À partir de la courbe d’étalonnage établie avec les valeurs Stables à 2-8 °C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption
de mesure des calibrateurs, on détermine la concentration figurant sur les étiquettes.
finale de calprotectine, en µg/g de selles, dans les Réactifs ouverts/ reconstitués
échantillons du patient. Tampon d’extraction Stables à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption
Replacer immédiatement les barrettes non
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION utilisées dans la pochette contenant le
Microplaque
dessiccateur puis la refermer soigneusement.
Quantité Stable à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption.
Réactifs Code Reconstitution
EK-CAL EK-CAL2 Tampon de lavage Stable à 2-8 °C pendant 6 mois après dilution
Tampon 3 flacons de 6 flacons de Tampon d’incubation
B-CAL-EX Prêt à l’emploi
d’extraction 125 mL 125 mL
Calibrateurs
Microplaque
Coatée avec un 2 x 12 x 8 Contrôles
12 x 8 puits B-CAL-MP Prête à l’emploi
Acm anti- puits Marqueur
Stables à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption
calprotectine enzymatique
Films adhésifs 3 pièces 6 pièces - Prête à l’emploi Substrat TMB
Tampon de
A reconstituer Solution stop
lavage
1 flacon de 2 flacons de avec 900 mL Stop Solution
concentré 10x B-CAL-WB
100 mL 100 mL d’eau déionisée
Avec Tableau 2
(chacun)
conservateurs
Revision date: 2018-04-10 18/60 BÜHLMANN fCAL® ELISAYou can also read
