Neues aus der Wissenschaft - New England Biolabs GmbH
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Frühjahr/Sommer 2021
Neues aus der Wissenschaft
Highlights dieser
Ausgabe:
INVESTIGATION
2 Originalartikel:
Ein schneller Workflow für die
Untersuchung von genomischen
Loci in Mäusen mittels Cas9 targeted
Sequencing
INNOVATION
4 COVID-19 Forschung:
Eine Auswahl angewandter
SARS-CoV-2 Detektionsprotokolle aus
der Praxis; COVID-19 Researcher
Spotlight: die neuen mRNA-Vakzine
7 Spezial – Molekulare
Diagnostik: NEB – der
zuverlässige Zulieferer für Biotech,
Pharma und die Molekulare Diagnostik
12 SARS-CoV-2 Seq mit NEB:
Neue NEBNext ARTIC Kits für
Illumina und ONT
INSPIRATION
10 Neue Produkte:
Monarch HMW DNA Extraction
Kits für Long-Read-Seq,
Klickbare Objekte im PDF sind durch folgedens Icon gekennzeichnet Immobilisierte T4 DNA Ligase,
oder (im Fließtext) in orangener und kursiver Schrift dargestellt PaqCI für GoldenGate Assembly
AUSZUG AUS ORIGINALARTIKEL
Ein schneller Workflow für die Untersuchung von genomischen
Loci in Mäusen unter Verwendung einer neuartigen
HMW-DNA-Extraktionsmethode vor Cas9 targeted Sequencing
Simon Lesbirel, Ph.D.1, Jeremy R. Charette, B.S.1, Chia-Lin Wei, Ph.D.1, Eric Cantor, Ph.D.2, Danielle Freedman, M.S.2, Giron Koetsier, Ph.D.2
1: The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME/Farmington, CT und 2: New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA
Lesen Sie hier einen Auszug aus dem effective assessment of DNA sequence. The CRISPR/ increasing efficiency and decreasing cost (3).
Originalartikel des Jackson Labs in Cas9-mediated amplification-free enrichment approach At The Jackson Laboratory, one of our priorities has been
Zusammenarbeit mit NEB: for Oxford Nanopore Technologies® sequencing is an to establish assays to standardize analysis for routine
alternative method for interrogation of loci of interest or assessment of genomic alterations such as targeted
Introduction transgene sites. The method is relatively low-cost and can mutagenesis and transgene integrations. Cas9 enrichment
Generation of transgenic mice through random or targeted enrich regions of interest over native sequences without has proven to be an effective approach. Simultaneous Cas9
integration of DNA fragments can lead to structural the need for PCR amplification (Figure 1). enrichment analysis of 2 to 4 targeted sequences has now
variation and integration mutagenesis (1), both of which In standard ligation-based whole genome sequencing been established as a standard workflow, with targeted
are undesirable outcomes. Due to the significant labor approaches, desired loci/transgenes will be sequenced regions typically being around 5 kb in size and sometimes
required for their characterization, it is estimated that only only once or a few times per nanopore sequencing up to 30 kb.
around 5% of transgenic mouse models published in the run, but not with enough coverage to collect reliable Successful use of the Cas9 enrichment protocol relies on
Mouse Genome Database have an annotated chromosomal sequence information. The Cas9 no-amplification using high-quality, high molecular weight (HMW) gDNA
location (1). Therefore, a technique capable of quickly and enrichment workflow allows for specific enrichment of as an input material. Working with the longest possible
cost-effectively identifying chromosomal location and targeted regions by reducing undesired fragments from DNA fragments increases the chance that the entire region
confirming the transgene sequence integrity is essential. the sequencing process via dephosphorylation of their of interest remains intact after DNA extraction. The initial
Further to this, the interrogation of large loci at the base phosphate ends. Lacking terminal 5´ phosphate groups, Cas9 enrichment sequencing workflow implemented
level between strains remains difficult without using whole they do not participate in adapter ligation. The target within the Genome Technologies group at The Jackson
genome sequencing. A recently described technique, Cas9 region, however, is subsequently cleaved using a Cas9- Laboratory was dependent on phenol/chloroform DNA
no-amplification enrichment (2), has the potential to fulfill sgRNA (single guide RNA) ribonucleoprotein complex extraction, which initially fulfilled the requirements.
that need. (RNP) making it accessible for sequencing adapter ligation. However, while the phenol/chloroform-based workflow
Traditionally, the genomic modifications required to The resulting libraries allow for enriched sequence is effective for ultralong sequencing, it proved to be
generate mouse models leverage PCR-based assays generation from the region of interest against a minimal laborious and time consuming when applied to the Cas9
and Sanger sequencing for validation. However, in background of genomic DNA sequences typically resulting enrichment protocol. The sample lysis, phenol extraction
many cases, the structure and the sequence of the gene from off-target Cas9 cleavage and non-specific adapter and DNA precipitation take approximately one full day.
or its chromosomal integration site hinder analysis by ligation. Furthermore, multiple sgRNAs can be used to Subsequently, this method requires up to 3 days of “rest
these methods. Loops and sequence repeats prevent enrich a variety of targets in a single library, thereby time” to allow the isolated HMW gDNA to return to
solution, resulting in the whole extraction process taking
several days. Accordingly, the Cas9 enrichment can be
Figure 1: Overview of the Cas9 no-amplification enrichment library prep workflow started around day 5 (Figure 3). In addition, the increased
Non-target HMW gDNA Target HMW gDNA frequency of extractions produced excessive amounts of
End blockage hazardous waste. Therefore, we sought a faster and more
Region of interest
by dephosphorylation environmentally friendly DNA extraction alternative.
In this work, we leveraged the novel glass bead-based
approach employed by the New England Biolabs
Target cleavage Monarch® HMW DNA Extraction Kits to significantly
by Cas9 RNP reduce the time required for generating HMW gDNA from
Cas9 P Cas9 mouse tissue samples. With this new approach, the HMW
RNP P RNP
DNA extraction process from tissues is complete in about
dA-tailing 90 minutes, and DNA is ready to use shortly after, thereby
significantly reducing the overall time required to perform
A P A
A A P the Cas9 enrichment workflow. Yield, purity, and integrity
of the isolated HMW DNA is compared to phenol-
Adapter ligation extracted DNA and its efficient use in the optimized Cas9
& cleanup Adapter (partial ligation) Adapter (full ligation) sequencing workflow is demonstrated.
Results & Discussion
Comparison of HMW DNA Extraction
Addition to nanopore
The HMW DNA that was used for initial Cas9 enrichment
flow cell
studies was isolated using phenol/chloroform extraction.
Nanopore Nanopore For later studies, the Monarch HMW DNA Extraction Kit
for Tissue was introduced. Yield and purity data are shown
2
TABLE 1: DNA Extraction with phenol/ FIGURE 3: Comparing the Cas9 sequencing
chloroform and the Monarch HMW DNA workflow duration for phenol/chloroform
Extraction Kit and Monarch HMW DNA extraction
Yield Tapestation analysis was carried out using the Genomic Monarch® HMW Phenol
Per A260/A280 DNA Screen Tapes. Densitometric region analysis revealed DNA Extraction extraction
Sample and Input Amount mg and
Sample (Lysis Agitation) (µg) A260/A230 that the portion of DNA >50 kb for the Monarch- Select sgRNA Select sgRNA
A–Liver, 15 mg 1.9 1.85, 1.33 extracted DNA was 81% while that of phenol-chlrorofom-
B–Liver, 15 mg 1.4 1.84, 1.12 extracted DNA was 69% (data not shown).
Phenol/
Day 1
C–Kidney, 20 mg 5.9 1.83, 2.08 Extract DNA Extract DNA
Chloroform Cas9-enrichment for assessment of
D–Kidney, 20 mg 4.2 1.86, 1.77
transgene insertion sites
Day 1
E–Kidney, 20 mg 3.8 1.85, 2.07
Day 2–4
Cas9 Library Prep Resuspend DNA
4–Liver, 15 mg (1700 rpm) 1.4 1.86, 2.27
The efficiency of the Cas9 enrichment approach is
5–Liver, 10 mg (500 rpm) 1.3 1.84, 2.14
6–Kidney, 17 mg (2000 rpm) 2 1.85, 2.27 demonstrated in Figure 2, showing analysis of Sample 5
MinION run Cas9 Library Prep
Monarch 7–Kidney, 20 mg (2000 rpm) 2.7 1.83, 2.25 (homozygous 30 kb insert) and Sample 4 (heterozygous
Day 2–3
10–Kidney, 12 mg (500 rpm) 1.4 1.85, 2.35 5 kb insert). Sample 5 contains a large insert and delivered
Day 5–6
11–Kidney, 10 mg (500 rpm) 1.9 1.84, 2.36 44X coverage over the region of interest. In Samples 4 Align and visualize MinION run
12–Kidney, 10 mg (500 rpm) 2.1 1.85, 2.34 and 9 (another mouse line with a 5 kb transgenic insert,
3 days
data not shown), the Cas9 enrichment approach was used
HMW DNA samples purified with either phenol/chloroform or the Align and visualize
Monarch kit were analyzed on a Nanodrop 2000 to determine the to check the integrity of the insertion site as well as the
concentration and purity ratios, and to determine yield per mg. DNA transgene sequence. The sgRNAs were designed 1 kb up 6 days
samples from kidney purified with the Monarch kit using 500 rpm and downstream of the transgene, and the enrichment
agitation speed during were bound for 8 minutes on the rotator.
approach worked well with a 92X and 74X coverage,
when working with animal tissues. The drawbacks of this
respectively. A slight overrepresentation of the shorter
extraction approach are numerous, including significant
for DNA extracted from liver and kidney samples with allele not containing the transgene was observed.
handling, hazardous chemicals, and excessive time required
both methods (Table 1, page 10)
Sample 6 and 7 (both heterozygous 5 kb inserts) proved for dissolving. Because this method requires several
For phenol-extracted samples, spectrophotometric readings to be difficult targets; even with the Cas9 enrichment days to obtain usable DNA, it is not conducive to rapid
revealed that around 1.6 μg DNA per mg tissue was approach, it was challenging to generate reads (data not transgene/strain analysis and limits the flexibility needed
isolated for liver and 4-6 μg per mg tissue for kidney. shown). Monarch HMW DNA extraction was repeated for troubleshooting or tweaking of parameters.
However, Qubit values (data not shown) were significantly with larger input amounts and lysis was carried out at
The new Monarch HMW DNA extraction workflow
lower, particularly for the liver samples. Purity grade was maximal agitation speed (2000 rpm) to reduce the size
provided DNA with high yields, high purity, and high
intermediate; though A260/A280 purity ratios were in the of the HMW DNA fragments and the accompanying
DNA integrity which was ready to use in only a few
normal range (1.83-1.85), the A260/A230 ratios were lower viscosity. This modification enabled 20X/23X coverage
hours. The Monarch-extracted DNA performed well in
than optimal, with 1.8-2.1 for kidney and only 1.1-1.3 for of the region of interest, respectively, sufficient for our
Cas9 sequencing and resulted in a significant time savings
liver. For Monarch-extracted samples, spectrophotometric purposes. This example provides a compelling case of
in the Cas9 enrichment sequencing workflow of up to
measurements revealed that good yields were obtained how having access to a rapid extraction method enables
3 days (Figure 3). The Monarch workflow also enables
for both liver and kidney, with around 1.4 μg DNA per troubleshooting experiments without significant time loss.
tunable fragment length generation by having the user
mg tissue for liver and 2-3 μg per mg tissue for kidney.
Consistent high purity was observed among all extracted Conclusion change the agitation speed of the thermal mixer during
Until recently, Cas9 enrichment workflows have been lysis, empowering the user to adjust the size of the DNA
samples as A260/A280 purity ratios were greater than 1.83
described using phenol/chloroform extracted HMW DNA to optimize conditions for the relevant downstream
and A260/A230 ratios were >2.1.
application. Overall, the Cas9 enrichment approach is a
A 60 kb
powerful tool for interrogation of genomic loci. Having a
A 60 kb rapid high-quality method like Monarch for HMW DNA
extraction enables a significant reduction in the workflow
time and facilitates troubleshooting efforts without adding
several days of work.
References:
1. Goodwin, L.O. et al. (2019) Genome Research. https://doi.org/10.1101/
gr.233866.117.
Figure 2: 2. Gilpatrick, T. et al. (2020) Nature Biotechnology 38, 433–438.
3. Oxford Nanopore Technologies (2020). “Cas9 Targeted Sequencing Before Start
Analysis of 30 kb Checklist Cas9 Targeted Sequencing,” 1–6.
8,690 bp
homozygous transgene
B
B 8,690 bp insertion and 5 kb
heterozygous transgene
insertions
(A) Sample 5: Homozygous 30 kb Laden Sie den vollständigen Artikel
insert; coverage across the region of als PDF unter
interest was 44X. (B) Sample 4: a
mouse line with a 5 kb heterozygous www.neb-online.de/
insertion, coverage depth of 92x. Note:
mean coverage depth does not include
MonarchHMW
endogenous chromosomal reads
located at the 5´ and 3´ ends of the Siehe auch Seite 10
transgenic insertion.
3 3
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4
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bis 10 pg) mit einem Bio-Rad CFX96 Real-Time-Instrument durchgeführt (20 µl Volumen/Reaktion mit je 200 nM Primer und Sonde).
Die Standardkurven der Amplifikation und die Effizienzen für jedes der 5 humanen Zielgene sind gezeigt. Alle fünf Targets wurden in den
Multiplex-Reaktionen mit hoher Effizienz und R2-Werten linear detektiert.
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RT-LAMP: RT-qPCR:
Screening for SARS-CoV-2 infections with Multiplexed RT-qPCR to screen for SARS- SalivaDirect: Simple and sensitive molecular
colorimetric RT-LAMP and LAMP sequencing COV-2 B.1.1.7, B.1.351, and P.1 variants of diagnostic test for SARS-CoV-2 surveillance
Dao Thi et al., Science Translational Medicine 12 Aug concern V.3 Vogels, C. et. al., MedRxiv 2020 Aug 08.
2020, Vol. 12, Issue 556 Chantal Vogels et.al., Protocols.io; 09. Feb. 2021 Die Yale University hat ein FDA-EUA-zertifiziertes
Seit Februar 2021 bietet die Uni Heidelberg Teil- An der Yale School of Public Health wurde ein Protokoll für extraktionsfreie dualplex RT-qPCR
nehmern genehmigter Präsenzveranstaltungen (und RT-qPCR Protokoll entwickelt, um die neuen Corona- Ansätze direkt aus Speichelproben entwickelt. Hierbei
später auch Mitarbeitern) freiwillige Tests mit einem Mutationen per RT-qPCR zu analysieren. Dazu wird sind detailliert alle notwendigen Komponenten
colorimetrischen LAMP Test auf Gurgelwasserproben das Luna RT-qPCR Kit #E3006 bzw. #E3007 von verschiedener Hersteller samt umfassender Arbeits-
an. Der Assay basiert auf NEBs #M1800 und der oben NEB eingesetzt. anleitung beschrieben. Von NEB wird neben der
zitieren Publikation. Positive Tests werden mit einem Proteinase K (#P8107) in der Probenaufbereitung das
IVD-zertifiziertem qPCR Ansatz nachvalidiert. COVID-19 RT-qPCR Testing Pipeline – Luna One-Step Probe RT-qPCR Kit (#E3006) zur
Vollständiges Protokoll Detektion eingesetzt.
Scalable, rapid and highly sensitive Heinen, R. et. al., Vienna COVID-19 Detection Initiative (VCDI)
isothermal detection of SARS-CoV-2 for
laboratory and home testing
Die Wiener COVID-19 Initiative hat ein umfassendes
Protokoll von Probenentnahme und -aufbereitung
Next-Gen-Seq:
Kellner et al., BioRxiv 2020 Jun 23.
(u.a. aus Speichel und Gurgelwasser) bis hin zur qPCR COVID-19 ARTIC v3 Illumina library
Am IMP in Wien wurde zuvor bereits ein LAMP-basierter Detektion etabliert und in Anwendung. Hier wird von construction and sequencing protocol V.5
Test etabliert (#M1804). Die Sensitivität und Robustheit NEB der Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit DNA Pipelines R&D et al., Wellcome Sanger Institute
des Assays wird durch mehrere Neuerungen verbessert: (#E3007) empfohlen: „(…) which is attractively priced
Multiplex-Primersets, ein schnelles Extraktions- und An- nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost)
and performs among the most sensitive One-step kits Quick, J., University of Birmingham
reicherungsprotokoll mittels Carboxy-Beads (Bead-LAMP)
we tested.“
sowie ein alternativer Farbstoff (Hydroxynaphtolblau,
Siehe auch Seite 12
HNB), der auf Metallionen statt auf den pH-Wert reagiert.
5Im COVID-19 Researcher Spotlight:
Die Entwicklung von mRNA Vakzinen
In unserem COVID-19-Researcher-Spotlight unterhält sich die Moderatorin Lydia Morrison mit der NEB
Wissenschaftlerin Bijoyita Roy über die aktuelle Entwicklung von mRNA-basierten COVID-19-Impfstoffen.
Einen Auszug aus unserem Interview lesen Sie hier. Im vollständigen, englisch-sprachigen Interview erfahren
Sie mehr über die beiden jüngst z ugelassenen RNA-Impfstoffe und wie NEB hilft, die mRNA-Impfstoff
entwicklung und -produktion zu verbessern. www.neb.com/COVID-19.
Bijoyita Roy, Ph.D.,
NEB Senior Scientist
Lydia Morrison: mRNA-Impfstoffe sind relativ wirklich effizient, und sie vereinfacht große Teile
neu. Was sind die Vorteile dieser neuen Technik? der frühen Forschungs- und Entwicklungsarbeit. Ausblick auf die nächste Folge:
Als Beispiel: Nur wenige Tage nachdem die
Bijoyita Roy: Nun, Messenger-RNA kann gut Sequenz des SARS-CoV-2-Genoms veröffentlicht Hören Sie das Interview
dosiert werden und führt zu einer transienten wurde, konnte bereits die DNA-Sequenz, die als mit Bas Oude Munnink
und schnellen Expression. Die in vitro Synthese Ziel für einen Impfstoff in Frage kommt, generiert vom Erasmus MC
ist gut standardisierbar und leicht zu skalieren. werden. Und das mRNA-Molekül zu synthetisieren, (Niederlande) über
Das sind einige der wichtigsten Vorteile der das für das Spike-Protein kodiert, war dann nur verschiedene SARS-
mRNA-basierten Technologieplattform. Derzeit noch eine Frage von wenigen Wochen. CoV-2-Stämme und was
sind mRNA-basierte Impfstoffe als Alternative zu
dazu beitragen kann,
herkömmlichen Impfstoffansätzen im Kommen. Lydia Morrison: Was sind also die Bas Oude Munnink
Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen den
Epidemien frühzeitig
Die Idee dahinter ist ganz einfach. Man stellt
eine RNA oder eine Messenger-RNA in einem beiden zugelassenen mRNA-Impfstoffen? zu erkennen und Ausbrüche von
Reagenzglas her und schleust sie in eine Zelle COVID-19 oder anderen Pathogenen in
ein, um die Zellmaschinerie zu kapern und das Bijoyita Roy: Die größte Ähnlichkeit besteht Zukunft zu verhindern.
gewünschte Protein herzustellen. Sobald die RNA darin, dass beide Impfstoffe die genetischen
Baupläne eines spezifischen Coronavirus-Proteins, www.neb.com/COVID19
in der Zelle angekommen ist, wird sie von der
zellulären Maschinerie translatiert und die Synthese des Spike-Proteins, enthalten. Wenn der Impfstoff
der Proteinantigene beginnt. Diese Antigene also in die Zelle injiziert wird, veranlasst er sie,
werden dann vom Immunsystem erkannt und es Spike-Proteine zu bilden, die dann im Körper
kommt zur Immunreaktion. Die Technik nutzt also freigesetzt werden und eine Immunreaktion
die Zelle des Impflings selbst als Bioreaktor, um anstoßen. Wirklich interessant ist, dass die mRNA-
das gewünschte Protein herzustellen. Sequenz der beiden Impfstoffe sehr unterschiedlich
Alles, was man braucht, ist die DNA-Sequenz, um ist, aber der Wirkmechanismus sowohl für den
die RNA herzustellen, an der man interessiert ist. Pfizer-BioNTech- als auch für den Moderna-
Sie verwenden also den gleichen Prozess für jedes Impfstoff genau derselbe ist und beide eine
Protein, und das macht diese ganze Plattform ähnliche Wirksamkeit zeigen.
SARS-CoV-2 Vaccine
WHAT? WHY?
AAAAAA
mRNA is
mRNA transient
HOW?
Expression
is rapid
DNA template
In vitro transcription Is easy
to titer
mRNA
Post-transcriptional modification Can
scale-up
AAAAAA
5´ Cap 3´ Poly(A) tail
6NEB – der zuverlässige Zulieferer für
Biotech, Pharma und die Molekulare Diagnostik
Viele Wissenschaftler kennen NEB als zuver- FEATURE ARTICLE ~
Think differently about your
lässigen Lieferanten für Forschungsreagenzien molecular diagnostics supply chain
und Kits. Dank jahrzehntelanger Erfahrung in By Tom Evans, Ph.D. and Salvatore V. Russello,
Ph.D., New England Biolabs, Inc.
der Molekularbiologie und Enzymologie sind wir
New England Biolabs® (NEB®) partners with customers globally to address the challenges faced by
innovators developing the molecular diagnostics (MDx) technologies required to address public health
and pandemic preparedness.
auch prädestiniert als wichtiger Zulieferer von
The current COVID-19 pandemic has impacted diagnostics supply chains and has belied the need
nearly every aspect of daily life. It has elevated for innovation and thinking differently about how
many of the challenges faced by clinical labs, diagnostics should be developed, manufactured,
and new and innovative solutions are required to and deployed.
address them. One strategy to help public health
Many scientists know NEB as a trusted reagent
professionals understand and control the spread
Reagenzien und Rohmaterial für die Molekulare
provider to the life science community. What many
of SARS-CoV-2 is the widespread testing of
do not know is that we also offer a portfolio of
millions of people around the world. Conventional
products that serve as critical components for a
RT-qPCR based tests performed in large,
wide array of diagnostics products and services.
centralized testing facilities have been the backbone
Extensive molecular biology and enzymology
of testing to date. Despite the rapid development
experience provide NEB with the unique ability
Diagnostik, Biotech und Pharma.
of these SARS-CoV-2 assays, dozens of new
to help customers solve the challenges inherent in At NEB, our emphasis on long-term research
modalities are being introduced to help close the
technology development and ultimately in scale-up resulted in us evaluating and working with
gap between the number of cumulative tests that
and commercialization. loop-mediated isothermal amplification (LAMP),
can be performed daily and the desired testing
capacity required to control and track the spread of an alternate approach originally developed at the
the virus. Eiken Chemical Co., Ltd. Over the last decade
Leveraging NEB's research program we combined a number of breakthroughs to
Numerous companies, diagnostic testing facilities, to influence product development for make the technology even more suitable for the
and academic institutes have introduced SARS- SARS-CoV-2 testing
Wir sind in der besonderen Lage, Kunden in diesen
molecular diagnostics community. This included
CoV-2 assays under the FDA’s Emergency Use novel engineered DNA polymerases, a new reverse
Authorization (EUAs). Based upon recent FDA NEB's founder, Dr. Donald Comb, prioritized basic transcriptase, the ability to set up reactions at
guidance, the priority of new EUAs reviewed by research ever since NEB was founded in the early room temperature using “WarmStart®” enzymes,
FDA will be on tests that increase testing accessibility 1970s, and this has influenced the product devel- multiplexing, and the ability to perform carryover
or significantly increase capacity. Additionally, opment direction of the company. Our research prevention. We also introduced a version of this
Bereichen von der Technologieentwicklung, über
new SARS-CoV-2 assays can be introduced by interests include finding new enzyme activities, technology that enables the visual detection of
Clinical Laboratory Improvement Amendments engineering enzymes specifically for biotechnology products amplified by LAMP and RT-LAMP. We
(CLIA) laboratories without going through the applications, and understanding how enzymes have also published extensively in this area (1).
EUA process. Still, such rapid progress has not been behave. This level of expertise and knowledge is
without challenges – it has exposed weaknesses in then harnessed by our development and production
teams to create robust enzymes and optimized Partnering with you from R&D to
Scale-up, bis hin zur Kommerzialisierung gezielt
workflows for commercialization. For example, production
NEB’s expertise in amplification has resulted in an
extensive portfolio of reagents for RT-qPCR and NEB is a company that scientists know and trust.
isothermal amplification, two technologies essential We pride ourselves on being a resource – not just
in today’s molecular testing landscape. In fact, through our product offerings and production capa-
und umfassend zu unterstützen.
many of NEB’s products have been already cited in bilities, but also through the support we provide
numerous publications and EUA protocols. to diagnostics assay development scientists – from
Currently, the gold standard for diagnostics testing R&D through to scale-up and commercialization.
is RT-qPCR, and most of today’s testing infrastruc- For this reason, NEB is an ideal partner as new
ture is based on this technology. It’s highly sensitive testing technologies are moved from the bench into
and robust, and NEB offers a number of products in production.
this area, as do many other suppliers. However, like Our support starts early in the R&D process, as
any technology, it has strengths and weaknesses. customers obtain information about our products
Mehr erfahren Sie im Leitartikel "Think differently
For example, it requires use of expensive equipment and technologies through our catalog, extensive
(a thermal cycler with fluorescence detection) and, web resources and support staff, and ultimately
in some cases, has longer turnaround times.
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about your m olecular diagnostics supply chain". Weitere Informationen sowie das
Die Autoren sind Dr. Tom Evans, wissenschaft- Finden Sie auf dieser und den folgenden zwei Seiten PDF des Artikels finden Sie unter:
licher Leiter und Dr. Sal Russello, Direktor unseres der NEB Aktuell Ausgabe eine Übersicht der kurz- www.neb-online.de/MDx
Customized Solutions Departments. fristig verfügbaren Möglichkeiten.
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bis hin zum Capping, Tailing und Cleanup nach zu realisieren. Unsere optimierten HiScribe in „GMP-grade“ zur Verfügung z.B. zur Herstellung
der Synthese. Alle NEB Produkte werden mit Kits ermöglichen Ihnen dabei bequeme in vitro therapeutischer mRNA im Großmaßstab.
jahrzehntelanger Erfahrung und Know-How in der Transkriptions (IVT) Workflows und die Synthese
Molekularbiologie entwickelt und hergestellt. von bis zu 180 µg RNA pro Reaktion.
"GMP-grade" RNA Synthese bis zum Gramm-Maßstab – kurzfristig bei NEB verfügbar:
Produkt NEB # Produkteigenschaften und Vorteile
Vaccinia Capping Enzyme M2080S Zuverlässiges System für das enzymatische, vollständige Capping; basiert auf dem Vaccinia Virus Capping Enzyme (VCE)
T7 RNA Polymerase M0251S/L RNA Polymerase für die in vitro mRNA Synthese; hohe Sequenzspezifität (T7 Phagen Promotor)
mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase fügt eine Methylgruppe an die 2′-O Position des ersten Nukleotids vor der Cap-Struktur des 5´
mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase M0366S Endes der RNA
RNase Inhibitor, Murine M0314S/L Rekombinant, inhibiert spezifisch die RNasen A, B und C; stabiler gegen Oxidation im Vergleich zur humanen Variante
Pyrophosphatase, Inorganic M0361S/L Katalysiert die Hydrolyse von anorganischem Pyrophosphat zu Orthophosphat
(E. coli)
DNase I (RNase-free) M0303S/L Entfernt kontaminierende (genomische) DNA aus RNA Proben, degradiert DNA templates in Transkriptionsansätzen
HiScribe T7 High Yield RNA E2040S Verschiedene Komponenten des Kits verfügbar in GMP-grade
Synthesis Components
* “GMP-grade” ist eine Bezeichnung, die NEB verwendet, um Reagenzien zu beschreiben, die unter besonders kontrollierten Produktionsbedingungen hergestellt werden. Die Anlagen wurden für die Herstellung von
Reagenzien unter strengeren Auflagen an Infrastruktur und Prozesskontrollen konzipiert, um besondere Produktspezifikationen und Kundenanforderungen zu erreichen. "GMP-grade" Reagenzien werden unter Einhaltung der
Vorgaben der Qualitätsmanagementsysteme ISO 9001 und ISO 13485 produziert. Gegenwärtig werden von NEB weder Produkte hergestellt noch verkauft, die als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe (APIs) bekannt sind.
NEB garantiert nicht die Beachtung aller Vorschriften der aktuellen Good Manufacturing Practice (GMP) Vorschriften bei der Produktion.
7Bitte klicken Sie auf den jeweiligen Produktnamen (kursiv & orange), um weitere Informationen zu erhalten
Reagenzien für die
Amplification-basierte Molecular Diagnostics (MDx)
Als langjähriger Zulieferer für die Molekulare Diagnostik (MDx) bieten wir eine große Auswahl an Enzymen und Reagenzien für PCR, qPCR, RT-qPCR
und isothermale Amplifikation. Dank unserer umfassenden Expertise auf diesem Gebiet entwickeln und optimieren wir (Designer-)Enzyme für eine Vielzahl
diagnostischer Anwendungen. Die folgende Tabelle fasst einige der von NEB erhältlichen Produkte für MDx zusammen. Alle gelisteten Produkte sind auch als
Großmenge oder in kundenspezifischen Formaten erhältlich.
CUSTOM FORMULATIONS
APPLICATION PRODUCTS PRODUCT NOTES AVAILABLE
DNA, Probe • Sensitive, reproducible and reliable performance
• ROX-free
Luna® Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) • Compatible with automation and reaction miniaturization
• Blue-dye-free
DNA, Dye • Room temperature stable for ≥ 24 hours
• L yo-compatible
Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003)
RNA (1-step), Probe
• Luna WarmStart RT paired with Hot Start Taq increases reaction specificity
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005)
and robustness
qPCR/RT-qPCR RNA (1-step), Dye
• Compatible with automation and reaction miniaturization • ROX-free
Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (NEB #M3019)
• Room temperature stable for ≥ 24 hours • Blue-dye-free
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006)
• High conc. ideal for viral targets (NEB #M3019)
Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) (NEB #E3007)
• Includes carryover prevention (NEB #M3019)
Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit (NEB #E3019)
• Novel thermostable RT
RNA (2-step)
PCR APPLICATIONS • Single-tube format • Blue-dye-free
LunaScript® RT SuperMix Kit (NEB #E3010)
• 13-minute protocol
Master Mixes
Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) • ~280X fidelity of Taq
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0492) • Consistent, fast, reliable performance • H
igh conc.
Standalone Enzyme & Buffer • Compatible with automation and reaction miniaturization • Glycerol free
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (NEB #M0493) • Room temperature stable for ≥ 24 hours
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB #M0491)
PCR/RT-PCR
• +/- Hot Start
Hemo KlenTaq® (NEB #M0332) • Amplification direct from blood
• High conc.
Hot Start Taq DNA Polymerase (NEB #M0495) • U
nique aptamer-based enzyme control supports fast protocols • H
igh conc.
Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB #M0496) • C
ompatible with automation and reaction miniaturization • Glycerol free
WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix
(DNA & RNA) (NEB #M1800) • Fast, clear pink-to-yellow visible detection of amplification
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix • Results in approximately 30 minutes
with UDG (NEB #M1804)
SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric • Simple, colorimetric detection of amplification of SARS-CoV-2 nucleic acid
LAMP Assay Kit (NEB #E2019) • Automation-compatible when coupled with absorbance plate reader
• Master mix for LAMP and RT-LAMP workflows
• L yo-compatible
WarmStart LAMP Kit (DNA & RNA) (NEB #E1700) • Supports multiple detection methods, including fluorescence and turbidity
LAMP • High conc.
• Automation compatible
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase (NEB #M0538) • Improved reaction properties compared to wild-type Bst DNA Polymerase • Glycerol-free
Bst 2.0 DNA Polymerase (NEB #M0537) • Increased dUTP tolerance enables carryover prevention • High conc.
• D NA binding domain fusion supports robust performance • Glycerol-free
Bst 3.0 DNA Polymerase (NEB #M0374)
• Significantly increased RT activity up to 72°C enables single enzyme RT-LAMP • High conc.
• In-silico designed RT for RT-LAMP with reversibly-bound aptamer that • Glycerol-free
WarmStart RTx Reverse Transcriptase (NEB #M0380)
inhibits activity below 40°C • High conc.
ISOTHERMAL Strand • Glycerol-free
Nt.BstNBI (NEB #R0607) • H
igh purity, high quality nicking endonuclease
APPLICATIONS Displacement • High conc.
• T hermostable
Tte UvrD Helicase (NEB #M1202) • High conc.
• Improves specifically of problematic fluorescent LAMP reactions
Helicase-dependent
Amplification
• Requires only two primer
IsoAmp II Universal tHDA Kit (NEB #H0110)
• P roduces short, discrete DNA products
Bsu DNA Polymerase Large Fragment (NEB #M0330) • E nables low temperature isothermal applications • High conc.
T4 Gene 32 Protein (NEB #M0300) • C
an increase yield and efficiency of amplification reactions • Glycerol-free
• H
ighly pure
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (NEB #N0447) • Custom conc.
• Individual mixes available
Other
• U
nique thermolabile version is completely inactivated in typical isothermal
Antarctic Thermolabile UDG (NEB #M0372) • High conc.
and RT-qPCR workflows
Proteinase K, Molecular Biology Grade (NEB #P8107) • Custom conc.
• Unique thermolabile version is completely inactivated in typical isothermal
Thermolabile Proteinase K (NEB #P8111) • Custom conc.
and RT-qPCR workflows
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Reagenzien für die
Next-Gen-Seq-basierte Molecular Diagnostics (MDx)
Die moderne Sequenzanalyse von DNA bzw. RNA ist ein wichtiger Baustein in der aktuellen Epidemiologie zur Überwachung des Infektionsgeschehens. Sowohl
in der Grundlagen- bzw. klinischen Forschung als auch in der Diagnostik werden immer häufiger Methoden entwickelt, um entweder das gesamte Genom oder
gezielt spezifische Genbereiche zu analysieren. Wichtig für optimale Next Generation Sequencing (NGS)-Ergebnisse sind dabei Arbeitsabläufe, die hochwertige
Bibliotheken mit hohen Ausbeute ermöglichen. Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen guten Überblick über NEBs NGS-Produkte für MDx. Alle gelisteten
Produkte sind auch als Großmenge oder in kundenspezifischen Formaten erhältlich.
Weitere Informationen zu unseren kundenspezifischen Lösungen für MDx/Biotech finden Sie auf unserer Webseite.
APPLICATION PRODUCTS NOTES
NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB #E7805)
® ™ ®
DNA library preparation with NEBNext Ultra II FS DNA Module (NEB #E7810)
enzymatic DNA fragmentation NEBNext Ultra II Q5® Master Mix (NEB #M0544)
NEBNext Adaptors and Primers
DNA Sequencing
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB #E7645)
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (NEB #E7546)
DNA library preparation for cfDNA
NEBNext Ultra II Ligation Module (NEB # E7595)
or pre-sheared DNA
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (NEB #M0544)
NEBNext Adaptors and Primers
NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat) (NEB #E7400)
NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (NEB #E7750)
Depletion of abundant RNAs • R ange of packaging options
NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria) (NEB #E7850)
including 96-well plates
NGS-BASED NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set for customized depletion (NEB #E7865)
• omponent and kit customization
C
MOLECULAR
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB #E7760) • Kitting
DIAGNOSTICS
NEBNext Ultra II RNA First Strand Synthesis Module (NEB #E7771) • Automation-compatible
NEBNext Ultra II Directional RNA Second Strand Synthesis Module (NEB #E7550) • S treamlined workflows
RNA library preparation NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (NEB #E7546)
NEBNext Ultra II Ligation Module (NEB #E7595)
RNA Sequencing
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (NEB #M0544)
NEBNext Adaptors and Primers
LunaScript RT SuperMix Kit (NEB #E3010)
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494)
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (NEB #E7546)
Virus sequencing and detection Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB #M0367)
NEBNext Quick Ligation Module (NEB #E6056)
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB #E7770)
WarmStart LAMP Kit (DNA & RNA) (NEB #E1700)
Weitere Informationen finden Sie unter: www.neb-online.de/MDx
oder Sie kontaktieren direkt unsere Spezialisten via custom.de@neb.com
Coming Soon: NEB Catalog & Technical Reference 2021/22 –
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9 9Schnell und zuverlässig DNA mit hohem Ihre Vorteile:
Molekulargewicht extrahieren – • Qualität –
Hochmolekulare DNA für Long
Monarch HMW DNA Extraction Kits Read Seq, Optical Mapping, de novo
Assembly etc.
Lange DNA-Fragmente für Long Read Sequencing sowie de novo Assembly, Genome Mapping oder Optical • Schnelle Workflows –
Mapping präparieren Sie ab sofort mit den neuen, innovativen Monarch High Molecular Weight (HMW) DNA HMW DNA aus Zellen in nur 30 min.,
Extraction Kits. Der neuartige, auf Glasperlen basierenden Ansatz, ermöglicht es Ihnen, DNA bis in den Mega- Blut: 60 min., Gewebe & Bakterien:
basen-Bereich (Mb) schnell und einfach zu extrahieren. So reinigen Sie HMW DNA mit exzellenter Ausbeute 90 min.
und Reinheit aus Zellen, Blut, Gewebe, Bakterien und anderen Probentypen auf. Die gewonnene HMW-DNA
lässt sich leicht wieder in Lösung bringen und ist daher oft noch am selben Tag einsatzbereit. So wird die Zeit
• Flexibel & anpassbar –
der Extraktion, bislang ein echter Engpass für Long-Read-Sequenzierungstechnologien, erheblich verkürzt.
Fragmentgrößen von 50-250 kb bis
zum XL Megabasenbereich
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• Sauber –
Geringste RNA-Kontaminationen oder
Proteinrückstände bei DIN >9,5
“ Ich habe so viele Kits und Protokolle für HMW DNA ausprobiert und
dieses ist mit Abstand das Beste (und Schnellste!). Ich bin wirklich begeistert!
– Mitarbeiterin Uniklinik Düsseldorf, Humangenetik
” Validierte Probenarten:
Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells &
“
Blood (#T3050):
Excellent fragment length as per TapeStation, excellent sequencing on ZELLEN
”
Oxford Nanopore Minion. This solved our bottleneck. • K293 • A549
• HeLa • U5Os
– Dr. Scott Lindner, Pennsylvania State University • NIH3T3 • HepG2
• Jurkat • NCI-460
• K562 (Suspensionszellen) • SK-N-SH
• HCT116 • Aa23
SÄUGETIERBLUT
Die DNA Fragmentgröße steuern Sie präzise über die Schüttlergeschwindigkeit in der Lyse • Human • Pferd
Cells (HEK293) Blood (human, fresh)
• Maus • Rind
Agitation speed
during lysis (RPM)
• Ratte (Frischblut) • Rhesusaffe
300 800 1100 1400 1700 2000 300 800 1100 1400 1700 2000
• Kaninchen • Ziege (Frischblut)
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
• Schwein • Schaf (Frischblut)
KERNHALTIGE BLUTZELLEN
• Huhn • Truthahn
Monarch HMW DNA Extraction Kit for Tissue
(#T3060):
• Maushirn • E. coli
727.5
727.5
679 679 • Mausleber • B. cereus
630.5
630.5
582 582 • Mausmuskel • M. luteus
533.5
533.5
485 485 • Mausniere • X. laevis
436.5
436.5
388
• Mausschwanz • S. cerevisiae
388
339.5 339.5 • Mausohr (Punches) • C. elegans
291
291
242.5
• Rattenniere • A. aegypti
242.5
194 194
145.5 145.5
97 97
Weitere Daten zu den Produkten
48.5 48.5
23 23 finden Sie unter:
www.neb.com/T3050 bzw.
www.neb.com/T3060
9.4 9.4
Yield (µg) 11.3 11.6 11.1 12.1 11.7 12.4 13.2 12.0 12.7 12.9 12.0 13.5 22.5 22.5 22.5 22.2 24.4 26.0 24.7 23.5 24.4 24.9 24.0 25.6
260/280 1.86 1.85 1.87 1.87 1.87 1.87 1.88 1.87 1.87 1.86 1.87 1.87 1.87 1.87 1.87 1.86 1.87 1.86 1.87 1.86 1.86 1.86 1.86 1.86 Best-in-class
260/230 2.31 2.28 2.36 2.44 2.39 2.47 2.49 2.50 2.52 2.53 2.48 2.44 2.50 2.57 2.54 2.42 2.40 2.44 2.35 2.48 2.37 2.37 2.46 2.38
yields and purity
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DIN 9.7 9.8 9.8 9.8 9.9 9.8 9.8 9.7 9.8 9.8 9.8 9.7 9.8 9.9 9.8 9.9 9.7 9.7 9.8 9.7 9.8 9.8 9.8 9.8
PRODUKT ART.NR. GRÖSSE PREIS
Abb.: Alle DNA-Isolationen wurden mit je zwei Replikaten von 1 x 106 HEK 293-Zellen bzw. 500 μl frischem menschlichem Blut durchgeführt. Monarch HMW 69 € /
DNA Extraction Kit T3050S/L 5/50 preps
Die Proben wurden während des Lyseschrittes mit der angegebenen Geschwindigkeit geschüttelt, um die kontrollierte Fragmentierung der DNA zu for Cells & Blood
398 €
gewährleisten. DNA aus den Replikaten (Zellen: 500 ng; Blut: 650 ng) wurde mittels PFGE aufgetrennt. Die Ausbeute- und Reinheitsverhältnisse der Monarch HMW
einzelnen Isolationen sind in den nebenstehenden Tabellen dargestellt. Lambda PFG Ladder und Lambda DNA-Hind III Digest (NEB #N3041 und #N3012) 74 € /
DNA Extraction Kit T3060S/L 5/50 preps 448 €
wurden als Molekulargewichtsstandards verwendet. Ausbeute, Reinheitsverhältnisse und DINs der einzelnen Preps sind in der Tabelle aufgeführt. for Tissue
10WEITERE PRODUKTNEUHEITEN
Optimal für Golden Gate Assembly –
PaqCI, das verbesserte Isoschizomer von AarI
NEB ist führend auf dem Gebiet des Golden
Gate Assembly: erst kürzlich haben unsere NEB
Kolleg*innen um Greg Lohman dies wieder gezeigt.
Es gelang ihnen, das vollständige Genom des
Bakteriophagen T7 in einer einzigen Reaktion aus
über 50 synthetischen Einzelfragmenten zusammen
zusetzen und replikationsfähige Phagen zu generieren.
Heute stellen wir Ihnen PaqCI, unser neuestes
Typ IIS Restriktionsenzym vor, das sich mit einer
Abb.: Verdau von 1 µg Lambda
7-Basen-Erkennungsstelle besonders für Golden
DNA mit je 8 Units PaqCI bzw.
Gate Assembly anbietet. Das verbesserte Isoschizomer AarI (Thermo Fisher) nach
von AarI ist ganz ohne Staraktivität zu 100% aktiv Herstellerangaben analysiert
bei 37°C im CutSmart Puffer. auf 1% Agarosegel. Während
PaqCI vollständige Schnitte
Alle Details zum Golden Gate Assembly sowie ohne Staraktivität zeigt, sind
beim Verdau mit AarI sowohl
Anleitungen, hilfreichen Tipps & Tricks und das Staraktivität als auch unverdautes
Paper zum 50+ Fragment Assembly finden Sie auf Weitere Informationen Substrat detektierbar.
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"Enzyme for Innovation": Ihre Vorteile:
die Immobilized T4 DNA Ligase!
• Praktisch –
Wir haben für Sie unsere Ligase an magnetische T4 DNA Ligase gekoppelt an magne-
Beads gekoppelt. So können Sie das Enzym z.B. tische Beads
auf einem Pipettierroboter nach der Ligation ohne • Einfach –
Hitzeinaktivierung per magnetischem Pull-down Schnelle Aufreinigung nach Reaktion
aus der Reaktion ganz einfach und elegant entfernen per magnetischem Pull-Down
und sogar mehrfach wiederverwenden. So sparen
Sie nicht nur Enzym, sondern auch wertvolle • Wiederverwendbar –
Pipettenspitzen und aufwendige separate "off-deck" Nutzen Sie das Enzym mehrere Male
Aufreinigungen.
NEBs imobilisierte T4 DNA Ligase ist bei
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dauter Lambda-DNA: Beide Varianten sind vergleichbar aktiv. DNA Ligase (6,600 CEU)
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Die Kits basieren auf dem ARTIC-Ansatz für Amplikon- Fax: +49/(0)69/305-23149
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