A Systematic Assessment of the Aquatic Exposure to Phytotoxins
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ETH Library A Systematic Assessment of the Aquatic Exposure to Phytotoxins Doctoral Thesis Author(s): Günthardt, Barbara Franziska Publication date: 2020 Permanent link: https://doi.org/10.3929/ethz-b-000488067 Rights / license: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information, please consult the Terms of use.
DISS. ETH NO. 27246
A SYSTEMATIC ASSESSMENT OF THE AQUATIC
EXPOSURE TO PHYTOTOXINS
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
BARBARA FRANZISKA GÜNTHARDT
MSc ETH Chemistry, ETH Zurich
born on 15.07.1991
citizen of
Küsnacht (ZH) and Adliswil (ZH)
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Juliane Hollender, examiner
Dr. Thomas D. Bucheli, co-examiner
Prof. Dr. Kristopher McNeill, co-examiner
Prof. Dr. Martin Scheringer, co-examiner
Prof. Dr. Hans Chr. Bruun Hansen, co-examiner
2020Summary
Summary
Today, many poisonous plant species are well-known due to their toxicity for humans. Responsible
for these effects are so-called phytotoxins, which are toxic plant secondary metabolites (PSM) with
widely varying structures. While their toxic impact on humans and animals is in many cases rather
clear, their environmental fate is generally much less understood. In view of the increasing
awareness for a healthy environment, phytotoxins pose an unknown risk. Particularly, the quality
of surface waters is essential for aquatic organisms, but also for humans as drinking water resource.
Bioactive compounds such as pesticides and pharmaceuticals were identified as major threat for
surface waters. Different exemplary case studies including estrogenic isoflavones or the
carcinogenic ptaquiloside showed that certain PSM classes can indeed also reach surface waters.
Together with some intrinsic properties of many phytotoxins, i.e. toxic and present in relatively
high amounts in the environment, phytotoxins have to be considered as potentially critical for
surface waters.
Therefore, this thesis aimed at a systematic assessment of the phytotoxins’ potential as aquatic
micropollutants in Swiss stream waters with the final goal to identify those phytotoxins and PSM
classes with an aquatic environmental exposure. Two theoretical steps were formulated covering
the establishment of a phytotoxin database and an assessment of the phytotoxins relevance for the
aquatic environment based on a persistence, mobility and toxicity (PMT) assessment. Two
additional steps comprise the real occurrence including a broad target and suspect screening and a
focused but more in-depth analysis of genotoxic pyrrolizidine alkaloids (PAs).
To begin, a Toxic Plants−PhytoToxins (TPPT) database was compiled through manual
combination of different literature and online sources from various fields, e.g. toxicology or food
safety. The database contains 1586 phytotoxins of potential toxicological and ecotoxicological
relevance in Central Europe linked to 844 species covering domestic, invasive, garden, and
agricultural plants. The main advantage of the TPPT database lies in the combination of phytotoxin
patterns in individual plant species with detailed information about both plants and toxins. The
biological information includes among others plant names, vegetation type, or distribution. The
phytotoxin identification, e.g. chemical abstracts service registry number, and structural
characterization, e.g. molecular formula, is further complemented with in-silico estimated
physicochemical and toxicological properties. Main limitations arise from unknown phytotoxin
patterns in many plant species, often uncertain toxicities on a molecular level, and generally unclear
ecotoxicity. The database is publicly available on the Agroscope homepage
(https://www.agroscope.admin.ch/-agroscope/en/home/publications/apps/tppt.html). Based
on the TPPT database, the phytotoxins were prioritized regarding occurrence, approximated from
the frequencies of Swiss plant species; environmental behaviour based on mobility and aquatic
persistence; and acute rodent and aquatic toxicity. The occurrence prioritization mainly served to
exclude toxins from rare plants, since no abundance data is available to quantify plant sources. The
vSummary PMT classification was based on the in-silico predicted properties. The mobility was assessed via the pH-dependent organic-carbon−water-partition coefficient (log Doc) and the persistence via degradation half-lives including biodegradation and hydrolysis. Many of the PSM classes showed a generally high mobility. The persistence was more variable with over a third of the compounds degrading rapidly. Nevertheless, the PMT assessment revealed that over 34% of the phytotoxins are potential aquatic micropollutants which were included in the following screening. The actual aquatic exposure was then investigated in two target and suspect screenings using high resolution mass spectrometry (HRMS). In the preliminary screening eleven grab water samples were taken in the Swiss plateau, concentrated with a broad solid-phase extraction (SPE), and analysed with liquid chromatography (LC) coupled to HRMS. From the 26 included targets three were detected, and from 78 suspects three were tentatively identified and six further fully confirmed by reference standards. Most widespread were the estrogenic isoflavones occurring at 73% of the sites, at which the isoflavone formononetin produced by red clover (Trifolium spp.) in grasslands was detected most frequently. The indole alkaloid gramine was also detected regularly with maximal concentrations up to 55 ng/L. Finally, the occurrence of seven PA was confirmed at one site. These alkaloids possibly originate from the invasive species Senecio inaequidens, the South African ragwort, which is especially concerning considering its genotoxicity that can be relevant at very low concentrations. This first screening revealed the aquatic exposure to different phytotoxins and indicated that further PSM classes might be relevant. Therefore, a second screening was conducted with an extended sampling strategy, i.e. including regional and seasonal variations, and a bigger target set. Water-level-proportional samples covering two days were taken monthly between May and October at seven sites in the Swiss plateau supplemented with 13 grab samples from different biogeographical regions. The performance of the used SPE-LC-HRMS method was evaluated for 134 phytotoxins with absolute method recoveries that were for approximately 90% of phytotoxins in the acceptable range of 70%-130% and limits of detection that were below 5 ng/L for 81% of the phytotoxins. Of the included phytotoxins, 39 were confirmed in at least one sample, which is almost 30%. Besides the previously identified phytotoxins different additional classes were detected. Two further alkaloid classes were present, quinolizidine alkaloids and tropolone alkaloids, but only in the low ng-L concentration range. More dominant were the detected coumarins, e.g. fraxetin or scopoletin, appearing with very high frequencies explainable by the high biomass of producing trees or the high number of different plant sources, respectively. Overall, a clear fraction of detected compounds were not previously categorized as PMT compounds, which might either be due to overestimated in-silico biodegradation, or due to a comparably high and constant emission. Additionally, three human derived phytotoxins were detected: nicotine from tobacco, caffeine from coffee and piperine from pepper. Several environmental factors were found to impact the toxin pattern and concentrations. The surrounding vegetation with different biogeographical regions and land usages determined the detected toxins, and rainy weather conditions at high plant vegetation, i.e. between July and August, led regularly to the highest concentrations. These results suggest a vi
Summary
wide aquatic exposure to phytotoxins. However, many details remained unknown, which were
further clarified for one PSM class in the following case study.
The case study aimed at dynamics, toxin patterns and source allocation of 26 PAs, a previously
detected PSM class relevant due to its genotoxicity. In the first part, a retrospective suspect analysis
was performed for two extensive Swiss surface water monitoring campaigns applying a HRMS
based method. Each campaign included five small streams in agriculturally influenced areas,
covered the growing season, and applied a continuous time-proportional sampling procedure. The
results revealed a wide aquatic exposure to PAs. The number of detected PAs per site ranged
between three and twelve, the temporal detection frequencies were at least 36% but went up to
87%, the average total PA concentration ranged between 3 and 21 ng/L, and the maximal total PA
concentration reached concentrations up to 98 ng/L. High peak concentrations were mostly
induced through rain events proposing a wash-out effect as transport process. Concentrations
generally increased in spring until maximal concentrations were reached in late spring and summer.
Based on the toxin patterns, three different PA-types (monoester, open diesters, and cyclic diesters)
could be attributed to different plant species with Senecio spp, as well as Echium vulgare as most
important PA sources. In the second part two small streams were monitored continuously to
distinguish different plant based and human PA sources. Additionally, a new method applying
online SPE-LC-MS/MS with a triple quadrupole instrument was developed for a faster and more
sensitive quantification in surface water. Through load calculations, human PA inputs, i.e. estimated
daily intake and excretion rates, could be excluded as relevant source. In contrast, the invasive S.
inaequidens and to a lesser extent the domestic S. jacobaea were identified as likely main source,
because the distinctly different PA fingerprint in aqueous plant extracts fitted the PA patterns in
stream waters. The measured concentrations further suggest that this invasive species can lead to
increased PA loads, if growing more abundantly. Finally, a possible risk was attributed to the
investigated Swiss streams due to the critical genotoxicity and regular exposure with obviously
rather persistent PAs.
In conclusion, the results of this thesis show that there is a considerable aquatic exposure to
phytotoxins in small Swiss streams. Through the systematic approach different PSM classes were
identified, prioritized and finally detected, of which certain alkaloid classes, phenylpropanoids, and
polyketides were most important. The occurrence and concentrations of individual phytotoxins
and patterns are influenced by several environmental factors. In the future, more mechanistic
insights, e.g. stability and sorption experiments, detailed plant abundances, and the overall
environmental fate covering the soil compartment would be needed to further distinguish the
relevance of different PSM classes. Finally, ecotoxicological information would be required to
classify the effect and establish a proper risk assessment of the aquatic exposure to phytotoxins.
viiviii
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Heute sind viele Giftpflanzen aufgrund ihrer Toxizität für den Menschen bekannt. Häufig sind
toxische Sekundärmetaboliten (PSM), sogenannte Phytotoxine, für die negativen Auswirkungen
verantwortlich, welche von diesen Pflanzen mit einer enormen Vielfalt an Strukturen produziert
werden. Während ihre toxischen Wirkungen auf Mensch und Tier relativ gut aufgeklärt sind, ist ihr
Umweltverhalten im Allgemeinen ungewiss. Angesichts des zunehmenden Bewusstseins für eine
gesunde Umwelt stellen Phytotoxine ein unbekanntes Risiko dar. Vor allem die Qualität von
Oberflächengewässern ist für aquatische Organismen, aber auch für den Menschen als
Trinkwasserressource, von entscheidender Bedeutung. Die negativen Auswirkungen bioaktiver
Mikroverunreinigungen wurden dabei als kritisch eingestuft, beispielsweise bei Kontaminierungen
mit Pestiziden oder Arzneimitteln. Verschiedene Fallstudien, unter anderem zu östrogenen
Isoflavonen oder zum krebserregenden Ptaquilosid zeigten, dass bestimmte PSM-Klassen
tatsächlich auch in Oberflächengewässer gelangen können. Zusammen mit den intrinsischen
Eigenschaften von Phytotoxinen, wie deren Toxizität und hohen Gehalte in Pflanzen, müssen
Phytotoxine als potenziell schädlich für die Qualität von Oberflächengewässer betrachtet werden.
Diese Arbeit strebte deswegen eine systematische Bewertung von Phytotoxinen als mögliche
aquatische Mikroverunreinigungen in Schweizer Fliessgewässern an mit dem Ziel, diejenigen
Phytotoxine und PSM Klassen mit einer aquatischen Exposition zu identifizieren. Zwei
theoretische Teile beinhalten den Aufbau einer Phytotoxin-Datenbank und eine Priorisierung der
Phytotoxine nach deren Relevanz für die aquatische Umwelt auf Grundlage von Persistenz,
Mobilität und Toxizität (PMT). Zwei weitere Teile umfassen das reale Vorkommen von
Phytotoxinen in Schweizer Oberflächengewässern einschliesslich eines breit angelegten Target-
und Suspect-Screenings und einer gezielten und detailierten Analyse genotoxischer
Pyrrolizidinalkaloide (PA).
Zunächst wurde eine Toxic Plants-PhytoToxins (TPPT) Datenbank durch manuelle Erfassung
mehrerer Literatur- und Onlinequellen aus verschiedenen Disziplinen, beispielsweise Toxikologie
oder Lebensmittelsicherheit erstellt. Die Datenbank enthält 1586 Phytotoxine von potenzieller
human- und ökotoxikologischer Relevanz in Mitteleuropa, welche mit 844 heimischen oder
invasiven Pflanzen, einschliesslich relevanter Garten- und Landwirschaftspflanzen, verknüpft sind.
Der Hauptvorteil der TPPT Datenbank liegt in der Kombination von Phytotoxinmustern in den
Pflanzen mit detaillierten Angaben, sowohl über die Pflanzen als auch über die Toxine. Die
biologischen Informationen umfassen unter anderem die Pflanzennamen, den Vegetationstyp oder
die Verbreitung. Die Phytotoxinidentifikation, z.B. die Registernummer vom Chemical Abstracts
Service, und die strukturelle Charakterisierung, z.B. Molekülformel, wird durch in-silico berechnete
physikalisch-chemische und toxikologische Eigenschaften weiter ergänzt. Haupteinschränkungen
ergeben sich aus unbekannten Phytotoxinmustern von vielen Pflanzen, oft unklaren
Humantoxizitäten auf molekularer Ebene, und generell unbekannten Ökotoxizitäten. Die
Datenbank ist auf der Agroscope-Homepage öffentlich verfügbar (https://www.agroscope.
ixZusammenfassung admin.ch/agroscope/en/-home/publications/apps/tppt.html). Basierend auf der TPPT-Daten- bank wurden die Phytotoxine bezüglich ihrem Vorkommen, angenähert aus der Verbreitung der Pflanzen in der Schweiz, ihrem Umweltverhalten basierend auf Mobilität und aquatischer Persistenz; und ihrer akuten Toxizität gegenüber Nagetieren und aquatischen Organismen priorisiert. Die Priorisierung des Vorkommens diente hauptsächlich dazu Toxine von seltenen Pflanzen auszuschliessen, da kaum Daten zur Quantifizierung der Pflanzenquellen vorhanden sind. Die PMT Klassifizierung basierte auf den in-silico vohergesagten Eigenschaften. Die Mobilität wurde durch den pH-abhängigen Verteilungskoeffizienten zwischen organischem Kohlenstoff und Wasser bestimmt. Die aquatische Persistenz wurde ebenfalls mittels Halbwertszeiten für Bioabbau und Hydrolyse berechnet. Viele der PSM-Klassen zeigten eine allgemein hohe Mobilität. Die Persistenz war variabler und mehr als ein Drittel der Verbindungen wurden schnell abgebaut. Dennoch ergab die PMT-Bewertung, dass über 34% der Phytotoxine potenzielle aquatische Mikroverunreinigungen sind, die in das folgende Screening einbezogen wurden. Die reale Wasserexposition wurde dann in zwei Target- und Suspect-Screenings mittels hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) untersucht. Im Vorscreening wurden elf Wasserproben im Schweizer Mittelland genommen, welche mit Festphasenextraktion (SPE) aufkonzentriert und mit Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt an HRMS, kurz SPE-LC-HRMS, gemessen wurden. Von den 26 Targets wurden drei nachgewiesen, und von 78 Suspects wurden drei vorläufig identifiziert und sechs weitere durch Referenzstandards vollständig bestätigt. Am weitesten verbreitet waren die östrogenen Isoflavone, die in 73% der Bäche gefunden wurden mit Formononetin als häufigstem Toxin, welches von Rotklee (Trifolium spp.), einer Graslandpflanze, produziert wird. Das Indolalkaloid Gramin wurde ebenfalls regelmässig nachgewiesen mit maximalen Konzentrationen von bis zu 55 ng/L. Weiterhin wurde das Vorkommen von sieben PAs an einem Standort bestätigt. Diese Alkaloide stammen möglicherweise vom invasiven Senecio inaequidens, dem Südafrikanischen Kreuzkraut, welches besonders im Hinblick auf seine Genotoxizität bedenklich ist, die schon bei sehr niedrigen Konzentrationen Effekte hervorrufen kann. Dieses erste Screening zeigte, dass verschiedene Phytotoxine in der aquatischen Umwelt vorkommen und deutet an, dass weitere PSM-Klassen relevant sein könnten. Daher wurde ein zweites Screening mit einer erweiterten Probenahmestrategie, d.h. unter Einbeziehung regionaler und saisonaler Schwankungen, und einer grösseren Targetliste durchgeführt. An sieben Standorten im Schweizer Mittelland wurden zwischen Mai und Oktober monatlich während zwei Tage wasserstandsproportionale Proben genommen, ergänzt durch 13 Einzelproben aus verschiedenen biogeographischen Regionen. Die Leistungungsfähigkeit der verwendeten SPE-LC-HRMS- Methode wurde für 134 Targets bewertet. Die absoluten Wiederfindungsraten der Methode lagen für etwa 90% der Phytotoxine im akzeptablen Bereich (70%-130%) und die Detektionsgrenzen waren für 81% der Phytotoxine unter 5 ng/L. Von den gemessenen Phytotoxinen wurden 39 in mindestens einer Probe bestätigt, was einer Detektionsrate von fast 30% entspricht. Neben den zuvor identifizierten Phytotoxinen wurden verschiedene weitere Klassen nachgewiesen. Zwei weitere Alkaloid Klassen waren vorhanden, nämlich Chinolizidinalkaloide und Tropolonalkaloide, x
Zusammenfassung
allerdings nur im niedrigen ng/L-Konzentrationsbereich. Dominanter waren die gefundenen
Cumarine, z.B. Fraxetin oder Scopoletin, die mit sehr hoher Häufigkeit auftraten, was sich durch
die grössere Biomasse von Bäumen oder der hohen Anzahl verschiedener Pflanzenquellen erklären
lässt. Insgesamt wurde ein deutlicher Anteil der nachgewiesenen Phytotoxinen zuvor nicht als
PMT-Verbindungen kategorisiert, was sich entweder auf überschätzte in-silico Halbwertszeiten des
biologischen Abbaus oder auf einen hohen und kontinuierlichen Eintrag zurückführen lässt.
Zusätzlich wurden drei Phytotoxine aus menschlicher Quelle nachgewiesen: Nikotin aus Tabak,
Koffein aus Kaffee und Piperin aus Pfeffer. Mehrere Umweltfaktoren beeinflussten das
Toxinmuster und die Konzentrationen. Die umgebende Vegetation aus unterschiedlichen
biogeographischen Regionen und mit verschiedenen Landnutzungen bestimmte die detektierten
Toxine, während regnerische Wetterbedingungen bei hoher Pflanzenvegetation, d.h. zwischen Juli
und August, regelmäßig zu den höchsten Konzentrationen führten. Diese Ergebnisse deuten auf
eine breite aquatische Exposition gegenüber Phytotoxinen hin. Viele Details blieben jedoch
unbekannt, welche für eine PSM-Klasse in der folgenden Fallstudie weiter geklärt werden sollten.
Die abschliessende Fallstudie zielte auf die Dynamik, die Toxinmuster und die Quellenzuordnung
von 26 PAs, einer zuvor entdeckten PSM-Klasse, die aufgrund ihrer Genotoxizität relevant ist. Im
ersten Teil wurde eine retrospektive Datenanalyse für zwei umfangreiche Monitoring Kampagnen
von Schweizer Oberflächengewässern durchgeführt. Jede Kampagne umfasste fünf kleine Flüsse
in landwirtschaftlich geprägten Gebieten, deckte die Wachstumssaison ab und wandte ein
kontinuierliches, zeitproportionales Probenahmeverfahren an. Die Ergebnisse zeigten eine breite
aquatische Exposition gegenüber PAs. Die Anzahl der nachgewiesenen PAs pro Standort lag
zwischen drei und zwölf, welche mindestens 36% der Zeit auftraten, aber auch bis zu 87% der Zeit
vorkommen konnten. Die durchschnittliche Gesamtkonzentration lag zwischen drei und 21 ng/L
mit einer maximalen Gesamtkonzentration von 98 ng/L. Hohe Spitzenkonzentrationen wurden
meist durch Regenereignisse induziert, was einen Auswascheffekt als Transportprozess nahelegt.
Die Konzentrationen stiegen im Allgemeinen über das Frühjahr an, bis maximale Konzentrationen
im späten Frühjahr und Sommer erreicht wurden. Durch die gefundenen Toxinmuster der drei
verschiedene PA-Typen (Monoester, offene Diester und zyklische Diester) konnten verschiedene
Pflanzenquellen identifiziert werden, bei welchen Senecio spp. sowie Echium vulgare dominierend
waren. Im zweiten Teil wurden zwei Bäche kontinuierlich peprobt um verschiedene pflanzliche
und menschliche PA-Quellen zu unterscheiden. Dafür wurde eine neue online SPE-LC-MS/MS
Methode auf einem Triple Quadropole Instrument entwickelt, um eine schnellere und
empfindlichere Quantifizierung von PAs in Oberflächengewässern zu gewährleisten. Mit Hilfe von
Frachtberechnungen konnten menschliche PA-Einträge durch den Konsum von mit PA-
kontaminiertem Tee und anschliessender Freisetzung über Abwasserbehandlungsanlagen als
relevante Quelle ausgeschlossen werden. Im Gegensatz dazu wurden das invasive Südafrikanische
Kreuzkraut (S. inaequidens) und in geringerem Masse das heimische Jakobskreuzkraut (S. jacobaea)
als wahrscheinliche Hauptquellen identifiziert, da der unterschiedliche PA-Fingerabdruck in den
verschiedenen wässrigen Pflanzenextrakten zu den PA-Mustern in den Wasserproben passte. Die
xiZusammenfassung gemessenen Konzentrationen deuten ferner darauf hin, dass diese invasive Art zu erhöhten PA- Frachten führen kann, wenn sie tatsächlich häufiger vorkommen als heimische Kreuzkräuter. Die regelmässige Exposition der untersuchten Schweizer Bäche mit genotoxischen persistenten PAs stellt ein mögliches Risiko dar. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, dass es in Schweizer Bächen eine beträchtliche aquatische Exposition mit Phytotoxinen gibt. Durch den systematischen Ansatz wurden verschiedene PSM-Klassen identifiziert, priorisiert und schliesslich in den Oberflächengewässer nachgewiesen, von welchen gewisse Alkaloide, die Polyketide sowie die Phenylpropanoide am häufigsten gefunden wurden. Das Vorkommen und die Konzentrationen der einzelnen Phytotoxine und deren Muster wurden durch verschiedene Umweltfaktoren beeinflusst. Für die Zukunft wären weitere mechanistische Erkentnisse, zum Beispiel aus Stabilitäts- und Sorptionsexperimenten, genaue Pflanzenvokommen, und das allgemeine Umweltverhalten, das den Boden miteinschliesst, hilfreich um die Relevanz der verschiedenen PSM-Klassen weiter zu differenzieren. Schliesslich wären ökotoxikologische Daten notwendig, um die Wirkung von Phytotoxinen zu klassifizieren und dadurch eine angemessene Risikobewertung der aquatischen Exposition gegenüber Phytotoxinen zu ermöglichen. xii
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