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ETH Library Pathomechanisms of Drug- Induced Liver Injury: (i) an in vitro model of nefazodone-induced cytotoxicity, and (ii) an in vivo model of valproic acid- induced hepatic steatosis and effects of treatment with an FXR ligand Doctoral Thesis Author(s): Krajnc, Evelin Publication date: 2020 Permanent link: https://doi.org/10.3929/ethz-b-000413094 This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information, please consult the Terms of use.
Diss. ETH No. 26747
PATHOMECHANISMS OF DRUG-INDUCED LIVER INJURY:
(i) an in vitro model of nefazodone-induced cytotoxicity, and (ii) an in vivo model of
valproic acid-induced hepatic steatosis and effects of treatment with an FXR ligand.
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. Sc. ETH Zurich)
Presented by
EVELIN KRAJNC
MSc in Pharmaceutical Sciences, University of Ljubljana
born September 22nd, 1988
citizen of Slovenia
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Hanns Ulrich Zeilhofer
Prof. Dr. Gerd-Achim Kullak-Ublick
Prof. Dr. Markus Stoffel
Zürich, 2020Summary
Drug-induced liver injury (DILI) is a rare event, but presents a significant medical issue
due to its challenging diagnosis and treatment. DILI can be mild and reversible, or
irreversible resulting in acute liver failure requiring liver transplantation. The
characterization of acute or long-term toxic effects of drugs, as well as methods of
circumventing or treating DILI, are the foundation of this work. This thesis consists of
two chapters addressing hepatotoxic effects of two commonly used drugs, nefazodone
and valproic acid, and furthermore assessing the possible protective effects of
cotreatment with a Farnesoid X Receptor (FXR) agonist.
The first part of this thesis is dedicated to valproic acid-induced DILI and the protective
effects of the FXR agonist obeticholic acid (OCA). Valproic acid (VPA) has been one
of the most widely used antiepileptic drugs over the past 40 years, known to lead to
fatty liver disease in more than 40% of patients. Steatosis is a typical clinical
manifestation of VPA and is characterized by an abnormal accumulation of lipids in the
cell. Oxidative stress plays a crucial part in the progression of non-alcoholic fatty liver
disease (NAFLD). This study aimed at investigating whether activation of FXR by
OCA, which is an effective treatment for NAFLD, can also prevent VPA-induced
steatosis in an in vivo mouse model. C57BL/6 mice were treated for four weeks with
OCA and then divided into two groups: co-treatment with OCA and VPA for an
additional four weeks or treatment with VPA alone to induce fatty liver disease.
Biochemical parameters, body mass, liver lab tests, and histology were examined. Gene
expression in the liver was tested by RT-PCR, comparing VPA-treated mice with or
without OCA co-treatment. In addition, next-generation RNA sequencing was
employed on liver samples from control, VPA and VPA+OCA-treated mice to explore
gene-expression profiles.
Liver sections, stained with hematoxylin-eosin, BODIPY 493/503 and Oil Red O
confirmed hepatocellular lipid accumulation in mice treated with VPA, with a marked
reduction in the accumulation of lipids in mice cotreated with OCA. FXR activation
was associated with the inhibition of VPA-induced oxidative stress, confirmed by RNA-
sequencing analysis. Specific genes necessary for the most abundant defence against
oxidative stress, glutathione, were confirmed to be upregulated by OCA with RT-PCR.
The data suggest that OCA reduced the accumulation of VPA-induced lipids in the liver
of mice as well as up-regulated glutathione antioxidant protective pathways. Our
IVfindings provide evidence for the protective role of OCA against VPA-induced fatty
liver.
The second part of this work is dedicated to nefazodone-induced hepatotoxicity. Acute
toxic effects of nefazodone were characterized by assessing intracellular ATP levels,
oxygen consumption rate (OCR), and the extracellular acidification rate (ECAR) using
the hepatocarcinoma Huh7 cell line and primary cultured hepatocytes. Additionally,
enzymatic assays were performed on purified enzymes or cell lysates and a
metabolomic profile of Huh7 cells was generated by liquid chromatography and mass
spectrometry. Nefazodone rapidly depleted Huh7 intracellular ATP content (IC50 44
µM, 95% CI 39-50), which was aggravated in galactose-containing medium (IC50 9.8
µM, 95% CI 9.0-11). Similarly, low concentrations of nefazodone inhibited only the
OCR (mitochondrial activity), whereas at higher concentrations both OCR and the
ECAR (anaerobic glycolysis) were inhibited simultaneously. Short-term exposure to
nefazodone altered the metabolite pattern associated with the ATP biosynthetic
pathways (e.g. tricarboxylic acid, glycolysis). Furthermore, enzymatic assays
confirmed that nefazodone inhibits the activity of glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH). At low concentrations, nefazodone inhibited mitochondrial
ATP production in Huh7 cells, while acting as an inhibitor of anaerobic glycolysis at
higher concentrations. Besides, we detected the protective effects of FXR activation
against nefazodone induced ATP depletion. In summary, the Huh7 cell model used in
this study, representing hepatocarcinoma cells that are relying heavily on glycolysis,
allowed us to identify glycolysis as a novel target of nefazodone. Programmed cell
death or apoptosis requires ATP, unlike necrosis, and worsens a hepatic injury. ATP
availability may be a key factor determining the outcome of DILI induced by
nefazodone.
Studies described in this thesis evaluated hepatotoxicity of nefazodone and valproic
acid with the aim, on the one hand, to better understand the risk as well as the severity
of DILI, and, on the other hand, to determine the potential protective effects of treatment
with OCA in combination with DILI causing drugs. In the case of nefazodone, it
protects energy production at the ATP level in vitro and in the case of VPA, it protects
the liver against oxidative stress in vivo. Such studies can open avenues for the potential
alleviation of long-term liver injury, generally reducing the risk of developing non-
alcoholic fatty liver disease, acute liver failure and, potentially requiring liver
transplantation.
VZusammenfassung
Arzneimittelinduzierte Leberschädigung (DILI) ist ein seltenes Ereignis, stellt jedoch
aufgrund seiner herausfordernden Diagnose und Behandlung ein erhebliches
medizinisches Problem dar. DILI kann mild und reversibel oder irreversibel sein und
zu einem akuten Leberversagen führen, das eine Lebertransplantation erfordert. Die
Charakterisierung akuter oder langfristiger toxischer Wirkungen von Arzneimitteln
sowie Methoden zur Umgehung oder Behandlung von DILI bilden die Grundlage dieser
Arbeit. Diese Arbeit besteht aus zwei Kapiteln, in denen die hepatotoxischen
Wirkungen von zwei häufig verwendeten Arzneimitteln, Nefazodon und Valproinsäure,
sowie die gleichzeitige Behandlung mit einem Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) -Aktivator
untersucht werden, um mögliche schützende Wirkungen festzustellen.
Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Valproinsäure-induzierten DILI und den
schützenden Wirkungen des FXR-Agonisten Obeticholic Acid (OCA). Valproinsäure
(VPA) war in den letzten 40 Jahren eines der am häufigsten verwendeten Antiepileptika,
von dem bekannt ist, dass es bei mehr als 40% der Patienten zu einer
Fettlebererkrankung führt. Steatose ist eine typische klinische Manifestation von VPA
und ist durch eine abnormale Ansammlung von Lipiden in der Zelle gekennzeichnet.
Oxidativer Stress spielt eine entscheidende Rolle beim Fortschreiten der NAFLD. In
dieser Studie wurde untersucht, ob die Aktivierung von FXR durch OCA, die eine
wirksame Behandlung für NAFLD darstellt, auch eine VPA-induzierte Steatose in
einem in vivo-Mausmodell verhindern kann. C57BL / 6-Mäuse wurden vier Wochen
lang mit OCA behandelt und dann in zwei Gruppen eingeteilt: eine zusätzliche
vierwöchige Co-Behandlung mit OCA und VPA im Vergleich zu einer Behandlung mit
VPA allein, um eine Fettlebererkrankung auszulösen. Es wurden biochemische
Parameter, Körpermasse, Leberlabortests und Histologie untersucht. Die
Genexpression in der Leber wurde durch RT-PCR getestet, wobei VPA-behandelte
Mäuse mit oder ohne OCA-Co-Behandlung verglichen wurden. Zusätzlich wurde eine
Hochdurchsatzmethode zur RNA-Sequenzierung an Leberproben von mit Kontrolle,
VPA und VPA + OCA behandelten Mäusen durchgeführt, um Genexpressionsprofile zu
untersuchen.
Mit Hämatoxylin-Eosin, BODIPY 493/503 und Oil Red O gefärbte Leberschnitte
bestätigten die hepatozelluläre Lipidakkumulation bei Mäusen, die mit VPA behandelt
wurden, mit einer deutlichen Verringerung der Lipidakkumulation bei Mäusen, die mit
VIOCA vorbehandelt wurden. Die FXR-Aktivierung war mit der Hemmung von VPA-
induziertem oxidativem Stress verbunden, was durch RNA-Sequenzierungsanalyse
bestätigt wurde. Glutathion ist zur Abwehr von oxidativem Stress notwending. Es
wurde bestätigt, dass spezifische Gene im Glutathion durch OCA mit RT-PCR
hochreguliert wurden.
Die Daten deuten darauf hin, dass OCA die Anreicherung von VPA-induzierten Lipiden
in der Leber von Mäusen verringert und gleichzeitig die Hochregulierung des
Glutathion-Antioxidans-Schutzwegesverursacht. Unsere Ergebnisse liefern Belege für
die Schutzfunktion von OCA gegen VPA-induzierte Fettleber.
Der zweite Teil dieser Arbeit ist der Nefazodon-induzierten Hepatotoxizität gewidmet.
Die akuten toxischen Wirkungen von Nefazodon wurden durch Bestimmung der
intrazellulären ATP-Spiegel, der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der
extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) unter Verwendung der Hepatokarzinom-
Huh7-Zelllinie und der primären Maus-Hepatozyten charakterisiert. Zusätzlich wurden
enzymatische Assays an gereinigten Enzymen oder Zelllysaten durchgeführt und ein
metabolomisches Profil von Huh7-Zellen wurde durch Flüssigchromatographie und
Massenspektrometrie erzeugt. Nefazodon führte zu einem schnellen Abfall der
intrazellulären ATP Konzentration (IC50 44 µM, 95% CI 39-50), der in
galaktosehaltigem Medium zusätzlich verstärkt wurde (IC50 9,8 µM, 95% CI 9,0-11).
In ähnlicher Weise hemmten niedrige Konzentrationen von Nefazodon nur die OCR
(mitochondriale Aktivität), wohingegen bei höheren Konzentrationen sowohl die OCR
als auch die ECAR (anaerobe Glykolyse) gleichzeitig gehemmt wurden. Kurzzeitige
Exposition gegenüber Nefazodon veränderte das mit den ATP-Biosynthesewegen
verbundene Metabolitenmuster (z. B. Tricarbonsäure, Glykolyse). Darüber hinaus
bestätigten enzymatische Tests, dass Nefazodon die Aktivität der Glycerinaldehyd-3-
phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) signifikant hemmt. In geringen Konzentrationen
inhibierte Nefazodon die mitochondriale ATP-Produktion in Huh7-Zellen, während es
in höheren Konzentrationen als Inhibitor der anaeroben Glykolyse fungierte. Außerdem
konnten wir die protektiven Effekte der FXR-Aktivierung gegen eine durch Nefazodon
induzierte ATP-Depletion nachweisen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in
dieser Studie verwendete Huh7-Zellmodell, das Hepatokarzinomzellen darstellt, die
stark auf Glykolyse angewiesen sind, es uns ermöglichte, Glykolyse als neuen
Angriffspunkt von Nefazodon zu identifizieren. Programmierter Zelltod oder Apoptose
erfordert im Gegensatz zu Nekrose ATP und verschlimmert eine Leberschädigung. Die
VIIVerfügbarkeit von ATP kann ein Schlüsselfaktor sein, der das Ergebnis des durch
Nefazodon induzierten DILI bestimmt.
In dieser Arbeit erläuterte Studien untersuchten die Hepatotoxizität von Nefazodon und
Valproinsäure mit dem Ziel, einerseits das Risiko und den Schweregrad von DILI besser
zu verstehen und andererseits die potenziellen Schutzwirkungen einer Behandlung mit
OCA in Kombination mit DILI verursachenden Arzneimitteln zu bestimmen. Im Falle
von Nefazdon, schützt es die Energieproduktion auf ATP-Ebene in vitro und im Falle
von VPA, schützt es die Leber in vivo vor oxidativem Stress. Solche Studien können
Wege zur potenziellen Linderung langfristiger Leberschäden eröffnen und das Risiko
für die Entwicklung einer nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung, eines akuten
Leberversagens und einer Lebertransplantation im Allgemeinen verringern.
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