Anti-MAG anti-Myelin Associated Glycoprotein Autoantibodies ELISA - EK-MAG 96 tests - Biovendor
←
→
Page content transcription
If your browser does not render page correctly, please read the page content below
anti-MAG
anti-Myelin Associated
Glycoprotein Autoantibodies
ELISA
EK-MAG 96 tests
Revision date: 2006-07-27
BÜHLMANN LABORATORIES AG
Baselstrasse 55
CH - 4124 Schönenbuch, Switzerland
Tel.: +41 61 487 1212
Fax: +41 61 487 1234
info@buhlmannlabs.ch2
ENGLISH Controls contain lot-specific amounts of anti-MAG
INTENDED USE antibodies. Refer to the additional control data sheet for
exact concentrations.
The BÜHLMANN anti-MAG ELISA is intended for
the quantitative in vitro diagnostic determination of
human IgM-autoantibodies directed against Myelin
Associated Glycoprotein (MAG) (1, 2).
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The anti-MAG autoantibodies ELISA employs the
quantitative enzymatically amplified sandwich-type
immunoassay technique. HIGHLY PURIFIED MAG
FROM HUMAN BRAIN (2) has been precoated onto a
microtiter plate. Calibrators and patient sera are
incubated for two hours in the microtiter wells and any
anti-MAG autoantibodies present are bound by the
immobilized human MAG. After washing away any
unbound substances, horseradish peroxidase (HRP)
labeled antibodies against human IgM are added to the
wells and incubated for another two hours. After a
wash step, the substrate solution containing
tetramethylbenzidin (TMB) is added to the wells and
incubated for 30 minutes. A blue coloration develops
in proportion to the amount of anti-MAG
autoantibodies bound in the initial step. The color
development is stopped by adding an acidic stop
solution (H2SO4) which turns the blue solution to
yellow. The intensity of the color absorbance is
measured in a microtiter plate reader at a wavelength
of 450 nm. The absorbance measured is directly
proportional to the concentration of anti-human MAG
autoantibodies. A set of human anti-MAG
autoantibody calibrators is used to plot a standard
curve of absorbance versus human anti-MAG
autoantibody titer units from which the concentrations
of anti-human MAG autoantibodies in the unknowns
can be calculated.
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION
Reagents Quantity Code Reconstitution
Microtiter Plate
12 x 8-well strips
96 wells precoated with B-MAG-MP Ready to use
with holder
human MAG
Plate Sealer 3 pieces
Wash Buffer Concentrate 1 bottle Dilute with 900 ml of
B-MAG-WB
(10x) 100 ml deionized water
Incubation Buffer 1 bottle
B-MAG-IB Ready to use
with preservatives 100 ml
Calibrators A to D1
Add 1 ml of
Human serum with 4 vials B-MAG-CASET
Incubation Buffer
preservatives
Low and High Control2
Add 1 ml of
Human serum with 2 vials B-MAG-CONSET
Incubation Buffer
preservatives
Enzyme Label IgM
Anti-human IgM antibody 1 vial Ready to use
conjugated to HRP in a B-MAG-ELM
11 ml Blue solution
protein-based buffer with
preservatives
TMB Substrate
1 vial
TMB in Citrate buffer with B-TMB Ready to use
11 ml
Hydrogen Peroxide
Stop Solution 1 vial Ready to use
B- STS
0.25 M Sulfuric acid 11 ml Corrosive agent
Table 1
1
After reconstitution, Standards A, B, C and D contain
70000, 15000, 3000 and 1000 Bühlmann Titer Units
(BTU) of anti-MAG antibodies, respectively.
Revision date: 2006-07-27 2/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISASTORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS plain tubes, avoid hemolysis, leave to clot for one hour
Unopened Reagents at RT (18-28°C), centrifuge for 15 minutes at
Store at 2-8°C. Do not use past kit expiration date printed on the label. approximately 1800 x g at RT and collect the serum.
Opened / Reconstituted Reagents Store serum samples at ≤-20°C. Samples are stable for
Return unused strips immediately to the foil pouch
containing the desiccant packs and reseal along the
≥1 year if stored at ≤-20°C. Avoid repeated freeze-
Microtiter Plate
entire edge of zip-seal. Store for up to 2 months at thaw cycles. Frozen samples should be thawed and
2-8°C.
mixed thoroughly by gentle swirling or inversion prior
Wash Buffer diluted Store for up to 2 months at 2-8°C.
to use.
Calibrators
Store for up to 2 months at -20°C.
Controls
Incubation Buffer ASSAY PROCEDURE
Enzyme Label IgM 1. Dilute all patient samples 1:1000 with Incubation
Store at 2-8°C until expiration date.
TMB Substrate Buffer (e.g. 2 µl of serum + 2 ml of Incubation
(protect from light)
Buffer). Allow diluted samples to set for one hour at
Stop Solution Store at 18-28°C until expiration date.
Table 2 18-28°C vortex from time to time. Put samples for
10 minutes on ice prior to pipetting in step 4c.
WARNINGS AND PRECAUTIONS 2. Prepare a plate with sufficient strips to test the
Calibrators (B-MAG-CASET) and Controls (B-MAG- desired number of calibrators, controls and samples.
CONSET) of this kit contain components of human Remove excess strips from the holder and reseal
origin. Each serum donor unit used in the preparation them in the foil pouch together with the desiccant
of the kit components was tested by an FDA approved packs without delay. Store refrigerated.
method and found negative for HBV surface antigen, Important: Use refrigerated reagent solutions in
so as for HCV and HIV1/2 antibodies. Although these steps 3. to 9.
methods are highly accurate, there is no guarantee that 3. Wash the coated wells four times using at least 300
this material cannot transmit Hepatitis or AIDS. µl of refrigerated Wash Buffer per well. Empty the
Therefore, all patient specimens and kit components wells and strike the plate firmly onto blotting
should be handled as if capable of transmitting paper.
infections. All products containing human source 4a. Pipet 100 µl of Incubation Buffer (as blank) in
material should be handled in accordance with good duplicate into wells A1+A2.
laboratory practice using appropriate precautions. Pipet 100 µl of Calibrator A in duplicate into wells
Substrate and Stop Solution: The Substrate Solution B1+B2.
(B-TMB) contains Tetramethylbenzidine (TMB), Pipet 100 µl of Calibrator B in duplicate into wells
hydrogen peroxide and dimethylformamide. The Stop C1+C2.
Solution (B-STS) contains sulfuric acid. Each of those Pipet 100 µl of Calibrator C in duplicate into wells
reagents is irritant to eyes, skin and mucous D1+D2.
membranes. Avoid contact with eyes, skin and Pipet 100 µl of Calibrator D in duplicate into wells
clothing. E1+E2.
4b. Pipet 100 µl of the Low Control in duplicate
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED into wells F1+F2.
• Precision pipettes with disposable tips: 2 µl, 100 Pipet 100 µl of the High Control in duplicate into
µl and 1 ml pipettes. wells G1+G2.
• Disposable polystyrene or polypropylene tubes for 4c. Pipet 100 µl of each diluted sample in
the preparation of sample dilutions. duplicate into the subsequent wells.
5. Cover the plate with a Plate Sealer and incubate for
• 1000 ml cylinder for the dilution of the Wash
2 hours (± 5 min) at 2-8°C.
Buffer Concentrate.
6. Remove and discard the Plate Sealer. Empty the
• Microtiter plate washer or squeeze bottle for Wash
wells and wash four times using at least 300 µl of
Buffer.
refrigerated Wash Buffer per well. Empty the
• Microtiter plate rotator. wells and strike the plate firmly onto blotting
• Microtiter plate reader for measurement of paper.
absorbance at 450 nm. 7. Add 100 µl of Enzyme Label IgM to all wells.
8. Cover the plate with a Plate Sealer and incubate for
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE
2 hours (± 5 min) at 2-8°C.
The procedure calls forwells and strike the plate firmly onto blotting RESULTS
paper. Standard Curve
Important: Allow TMB substrate solution to reach • Record the absorbance at 450 nm for each
18-28°C. calibrator.
10. Add 100 µl of the TMB Substrate Solution to • Average the duplicate values.
each well. • Plot the average absorbance values (vertical y-axis)
11. Cover the plate with a Plate Sealer, place the versus BTU (see next chapter) of the calibrators
plate on a plate mixer set at 800-1000 rpm, protect (horizontal x-axis) using a lin/log graph paper.
the plate from direct light and incubate for 30 • Draw the best fitting curve or calculate the
minutes (± 5 min) at 18-28°C. standard curve using a spline smoothed fitting
12. Add 100 µl of Stop Solution to all wells. algorithm.
Remove air bubbles with a pipette tip. Proceed to Samples and Controls
step 13. within 30 minutes. • Record the absorbance at 450 nm for each sample
13. Read the absorbance at 450 nm in a microtiter and control well.
plate reader. If wavelength correction is available, • Average the duplicate values.
set instrument to dual wavelength measurement at • Locate the absorbance values of the samples and
450 nm with background wavelength correction set controls on the vertical axis, draw a horizontal line
at 600 or 620 nm. intersecting the standard curve and read from the
horizontal axis.
NOTE: If the microtiter plate reader is not capable of
reading absorbance greater than 2 or greater than the
absorbance of the highest calibrator (Calibrator A), a
second reading at a wavelength of 490 or 492 nm is
recommended (reference filter at 600 or 620 nm if
available). In this case, proceed to construct a second
standard curve with the absorbance readings of all
calibrators at 490 or 492 nm. The concentration of the
off-scale samples at 450 nm are then read from the new
standard curve as described above. The readings at 490
or 492 nm should not replace the on-scale readings at
450 nm.
Examples of Results and of Standard Curve (see
Table 11 and Figure 1)
These results and standard curve are provided for
demonstration purposes only. A standard curve must
be generated for each set of samples to be assayed.
CUT-OFF VALUES AND STANDARDIZATION
The frequency of anti-MAG antibodies in normal
human sera was determined using blood samples from
asymptomatic volunteer blood donors (adult men and
women at the age of 18 to 70 years). 150 samples
were assayed according to the assay procedure and the
results listed in Table 12 were obtained.
NOTE: These titer ranges should be used as guidelines
only. It is recommended that each laboratory
establishes its own expected ranges for its patient
population.
Proposed Cut-off Titer
The mean + 3SD results in a technical cut-off value of
729 BTU. For practical reasons, we recommend to use
a CUT-OFF VALUE OF 1000 BTU, corresponding to
the lowest calibrator (= Calibrator D) in the standard
curve.
Standardization
The calibrators of the BÜHLMANN anti-MAG
ELISA kit were calibrated against an internal
Revision date: 2006-07-27 4/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISAReference Pool. The Reference Pool consists of more subsequently assayed according to the assay procedure
than 10 human sera containing low, medium and high (cf. Table 15). It is suggested that the relatively high
titers of anti-MAG antibodies, respectively. Titers and deviation in about 50% of the samples is due to
specificity of each serum in the reference pool were antibody aggregations. In general, pathological sera
first analyzed by anti-MAG immunoblots. show strongly elevated titer of autoantibodies
The Bühlmann Titer Units (BTU) were established therefore it has no influence to the positive/negative
as follows: discrimination.
• Normal donor samples were assayed according to Analytical Sensitivity: 444 BTU. 20 duplicates of
the anti-MAG ELISA assay procedure. incubation buffer were assayed in a single run. Mean
• Serially diluted samples of the Reference Pool were and standard deviation were calculated for the
assayed in the same run. absorbance values. The minimal detectable dose of
• The dilution at which the Reference Pool sample anti-MAG antibodies was calculated to be 444 BTU
falls short of the cut-off corresponds to the titer of the by adding two standard deviations to the mean
reference pool. absorbance and intersecting this value with the
NOTE: Serum titer values depend on the assay method standard curve obtained in this run.
and, in particular, on the specificity and the cut-off Functional sensitivity: 900 BTU. 20 duplicates of
values established with an individual assay method. low titer anti-MAG autoantibodies were assayed in a
Therefore, titer values obtained with different methods single run. Mean, standard deviation (SD) and
cannot be compared directly. coefficient of variation (CV) were calculated from the
absorbance values. We found a titer of 900 BTU with
QUALITY CONTROL
a CV less than 10%.
A thorough understanding of this package insert is
necessary for the successful use of the product. Specificity: Four sets of experiments were performed
Reliable results will be obtained only by using precise to assess the specificity of the BÜHLMANN anti-
laboratory techniques (current GLP guidelines) and MAG ELISA:
accurately following this package insert. 1. NEUTRALIZATION OF ANTI-MAG AUTOANTIBODIES:
Since there is no control serum for anti-MAG Five sera with high anti-MAG titers could be inhibited
antibodies commercially available, we recommend to from binding to the microtiter plates coated with MAG
use a positive serum pool for internal quality controls. in a concentration-dependent manner when
All controls must fall within established confidence preincubated for one hour with Incubation Buffer
limits. The confidence limits for the Controls are lot- supplemented with 1 to 200µg/ml of MAG prior to
specific and printed on the additional data sheet. testing in the ELISA.
The reproducibility of standard curve parameters and 2. SPECIFICITY OF ANTI-MAG AUTOANTIBODY BINDING:
control values should be within established limits of Five sera with medium to high anti-MAG
laboratory acceptability. If the precision of the assay autoantibody titers and five negative sera were tested
does not correlate with the established limits and on a GanglioCombi (EK-GCO) plate coated with
repetition excludes errors in technique, check the asialo-GM1, GM1, GM2, GD1a, GD1b and GQ1b.
following issues: i) pipetting, temperature controlling None of the sample showed ratio higher than 10%
and timing devices ii) ELISA reader settings iii) (Cut-off ratio >12%). Similarly, six sera with high anti-
expiration dates of reagents iv) storage and incubation Ganglioside autoantibody titers (see above) and five
conditions v) TMB Substrate Solution should be negative sera, were tested on plates coated with MAG.
colorless vi) purity of water. None of these disease state sera gave a signal higher
than 300 BTU.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS 3. COMPARISON TO IMMUNOBLOT (WESTERN BLOT): 127
patient sera (40 female; 87 male; age 4-90 years) with
Intra-Assay Precision (Within-Run): 6.5%. The
neurological diseases suspectedly caused by anti-
intra-assay precision was calculated from the results of
MAG autoantibodies were tested by the ELISA and a
20 pairs of values obtained in a single run (cf. Table
western blot method, respectively. MAG isolated
13).
from human central nervous system (CNS) was used
Inter-Assay Precision (Run-to-Run): 15.4%. The in both methods. All 12 sera showing medium to very
inter-assay precision was calculated from the results of high titers of anti-MAG IgM autoantibodies in the
20 pairs of values obtained in 20 different runs (cf. ELISA procedure were also clearly positive when
Table 14). analyzed on immunoblots. 114 out of 115 sera
Dilution Linearity/Parallelism: 147%. 7 human showing anti-MAG IgM antibody titers below the
serum samples containing high titer of anti-MAG ELISA cut-off value were also negative when
antibodies were diluted with Incubation Buffer 1:1000 analyzed on immunoblots, whereas 1 serum was
to 1:64000, left for one hour at 18-28°C and
Revision date: 2006-07-27 5/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISAslightly positive by the immunoblot method only (F. ČESKY
Ferracin and A.J. Steck, unpublished results). POUŽITÍ
4. COMPARISON TO INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE Souprava anti-MAG ELISA firmy BÜHLMANN je
ASSAY (IFA): Sera from 150 patients (unknown sex určena pro kvantitativní in vitro diagnostické
and age) diagnosed as having IgM monoclonal stanovení IgM autoprotilátek proti glykoproteinu
gammopathies were tested by the ELISA and an IFA asociovanému s myelinem (Myelin Associated
method, respectively. In the IFA method, sera were Glycoprotein -MAG) (1, 2).
incubated on frozen and aceton-fixed monkey sciatic
nerve sections and bound anti-MAG antibodies were PRINCIP METODY
detected by FITC-labeled anti-human IgM antibody. Test ELISA na autoprotilátky proti MAG je
26 patients (17.3%) were positive and 115 patients imunometrickou enzymovou sendvičovou reakcí
(76.7%) were negative in both methods, whereas 5 v pevné fázi. Mikrotitrační destička je potažena
sera (3.3%) were positive in the IFA method only and VYSOCE PURIFIKOVANÝM LIDSKÝM MAG ANTIGENEM
4 sera (2.7%) were only positive in the ELISA (2) s nejvyšší specificitou a senzitivitou. Kalibrátory,
method, respectively (3). kontroly a vzorky séra se inkubují dvě hodiny (2-
8°C)v mikrotitračních kyvetách a veškeré přítomné
autoprotilátky proti MAG se navážou na
imobilizovaný lidský MAG. Po vymytí všech
nenavázaných substancí se do kyvet přidají protilátky
proti lidskému IgM značené křenovou peroxidázou
(HRP) a proběhne další inkubace po dobu 2 hodin (2-
8°C). Po dalším promytí se přidá substrát obsahující
tetrametylbenzidin (TMB) a inkubuje se 30 minut.
Dojde k modrému zbarvení, které je úměrné množství
autoprotilátek navázaných v prvním kroku. Barvení se
ukončí přidáním kyselého zastavovacího roztoku
(H2SO4), který změní modrý roztok na žlutý.
Absorbance změřená při vlnové délce 450 nm je
přímo úměrná koncentraci autoprotilátek ve vzorku.
Sada kalibrátorů pro autoprotilátky proti MAG slouží
k vytvoření kalibrační křivky, pomocí níž je možné
vypočítat koncentraci vzorku.
DODÁVANÉ REAGENCIE A PŘÍPRAVA
Katalogové
Reagencie Množství Rekonstituce
číslo
Mikrotitrační destička 12 x 8 - kyvet s B-MAG-MP Připravená k použití
potažená lidským MAG držákem
Krycí fólie 3 ks
Koncentrát
promývacího pufru Nařeďte 900 ml
1 lahvička
(10x) B-MAG-WB deionizované
100 ml
S konzervačními vody
látkami
Inkubační pufr
1 lahvička Připravený k
s konzervačními B-MAG-IB
100 ml použití
prostředky
1
Kalibrátory A až D
Přidejte 1 ml
Lidské serum s
4 ampule B-MAG-CASET inkubačního
konzervačními
pufru
prostředky
Kontrolní sérum
vysoká/nízká hladina
2 Přidejte 1 ml
B-MAG-
2 ampule inkubačního
Lidské serum s CONSET
pufru
konzervačními
prostředky
Enzymový marker
IgM
Protilátka proti
1 ampule Připravený k
lidskému IgM
B-MAG-ELM použití
konjugovaná s HRP v 11 ml
Modrý roztok
proteinovém pufru s
konzervačními
prostředky
Substrát TMB Připravený k
1 ampule
TMB v citrátovém pufru B-TMB použití
11 ml
s peroxidem vodíku
Zastavovací roztok 1 ampule B- STS Připravený k
Revision date: 2006-07-27 6/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISA0.25 M kyselina sírová 11 ml použití SKLADOVÁNÍ A TRVANLIVOST REAGENCIÍ
Korozivní láka
Tabulka 1 Neotevřené reagencie
1
Po rekonstituci obsahují kalibrátory A, B, C a D 70000, Skladujte při 2-8°C. Nepoužívejte po uplynutí expirace.
15000, 3000 resp. 1000 titračních jednotek Bühlmann Otevřené / rekonstituované regencie
(Bühlmann Titer Units - BTU) protilátek proti MAG. Nepoužívané proužky vraťte ihned do sáčku se sušidlem
2
Množství protilátek proti MAG obsažené v kontrolách Mikrotitrační destička a uzavřete zip po celé délce. Skladujte při teplotě 2-8°C
závisí na šarži. Přesné údaje o koncentracích najdete v do expirace.
Promývací pufr Skladujte nejvýše 2 měsíce po rekonstituci při teplotě 2-
příslušném příbalovém letáku.
naředěný 8°C.
Kalibrátory
Skladujte nejvýše 2 měsíce při teplotě -20°C.
Kontroly
Inkubační pufr
Enzymový marker
IgM Skladujte při teplotě 2-8°C do expirace.
Substrát TMB (chraňte
před světlem)
Zastavovací roztok Skladujte při teplotě 18-28°C do expirace.
Tabulka 2
BEZPEČNOSTNÍ UPOZORNĚNÍ A OPATŘENÍ
Kalibrátory (B-MAG-CASET) a kontroly (B-MAG-
CONSET) v této soupravě obsahují komponenty
lidského séra. Každé sérum použité pro přípravu této
soupravy bylo testováno metodami schválenými FDA
a shledáno negativním na povrchový antigen HBV a
protilátky proti HCV a HIV1/2 . Přestože tyto metody
jsou vysoce přesné, neexistuje záruka, že tento
materiál nemůže přenášet hepatitidu nebo AIDS.
Proto se všemi pacientskými vzorky a komponenty
soupravy musí být nakládáno, jako by byly
potenciálně infekční. Se všemi výrobky obsahujícími
lidský materiál je nutno nakládat v souladu s dobrou
laboratorní praxí při dodržení všech bezpečnostních
opatření.
Substrát a zastavovací roztok: Substrát (B-TMB)
obsahuje tetrametylbenzidin (TMB), peroxid vodíku a
dimetylformamid. Zastavovací roztok (B-STS)
obsahuje kyselinu sírovou. Tyto látky dráždí oči, kůži a
sliznice. Vyvarujte se kontaktu s očima, kůží a oděvem.
POTŘEBNÉ LABORATORNÍ VYBAVENÍ A POMŮCKY
• Přesné pipety se špičkami na jedno použití: 2 µl,
100 µl a 1 ml.
• Polystyrenové nebo polypropylenové zkumavky
na jedno použití pro ředění vzorku.
• Odměrný válec 1000 ml pro naředění promývacího
pufru.
• Myčka miktrotitračních destiček nebo stříkací
láhev na promývací pufr.
• Rotátor na mikrotitrační destičky.
• Fotometr na mikrotitrační destičky s optickým
filtrem (450 nm).
ODBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKU
Množství vzorku potřebné pro toto stanovení jeobyčejných zkumavek tak, aby nedošlo k hemolýze, 8. Přikryjte destičku fólií a nechejte inkubovat
promíchejte několikerým převrácením zkumavky a 2 hodiny (± 5 min) při teplotě 2-8°C.
nechejte vysrážet jednu hodinu při pokojové teplotě 10. Odstraňte fólii. Vyprázdněte kyvety a vymyjte je
(18-28°C). Proveďte centrifugaci při 1800 x g po dobu chlazeným promývacím pufrem, a to čtyřikrát,
15 minut při pokojové teplotě (18-28°C) a odeberte vždy nejméně 300 µl na každou kyvetu.
sérum. Vyprázdněte kyvety a důkladně vysušte
Uchovávejte vzorky zamražené na teplotu ≤-20°C. Při vyklepáním na savý papír.
této teplotě jsou vzorky stabilní po dobu ≥1 rok. Důležité: Nechejte substrát TMB vytemperovat na
Vyvarujte se opakovaného rozmrazení a zmrazení teplotu 18-28°C.
vzorku. Zmražené vzorky se musí nechat rozpustit a 10. Do všech kyvet přidejte 100 µl substrátu TMB.
před použitím řádně promíchat jemným kroužením 11. Přikryjte destičku fólií, umístěte ji na rotátor
nebo převracením. nastavený na 800–1000 rpm, a nechejte inkubovat
30 minut (± 5 min) při teplotě 18-28°C. Přitom
POSTUP MĚŘENÍ destičku chraňte před přímým světlem.
3. Nařeďte všechny vzorky inkubačním pufrem v 12. Do všech kyvet přidejte 100 µl zastavovacího
poměru 1:1001 (např. 2 µl séra + 2 ml inkubačního roztoku. Špičkou pipety odstraňte vzduchové
pufru). Nechejte naředěné vzorky hodinu stát při bubliny.
teplotě 18-28°C, s občasným promícháním (Vortex). 13. Do 30 minut změřte absorbanci při 450 nm.
Před pipetováním, viz krok 4c, dejte vzorky na 10 Doporučujeme provést bichromatické měření
minut na led. s vlnovou délkou referenčního filtru 600 - 620 nm.
4. Připravte si destičku s dostatečným počtem proužků
k testování požadovaného počtu kalibrátorů, kontrol
a vzorků. Zbývající proužky ihned vraťte do sáčku
se sušidlem. Uložte v chladu.
Důležité: V krocích 3 až 9 používejte chlazené
reagencie (2-8°C).
3. Vymyjte mikrokyvety chlazeným promývacím
pufrem, a to čtyřikrát, vždy nejméně 300 µl na
každou kyvetu. Vyprázdněte kyvety a důkladně
vysušte vyklepáním na savý papír.
4a. Napipetujte dvakrát 100 µl inkubačního pufru
(blank) do kyvet A1+A2.
Napipetujte dvakrát 100 µl kalibrátoru A do kyvet
B1+B2
Napipetujte dvakrát 100 µl kalibrátoru B do kyvet
C1+C2.
Napipetujte dvakrát 100 µl kalibrátoru C do kyvet
D1+D2.
Napipetujte dvakrát 100 µl kalibrátoru D do kyvet
E1+E2.
4b. Napipetujte dvakrát 100 µl nízké hladiny
kontroly do kyvet F1+F2.
Napipetujte dvakrát 100 µl vysoké hladiny kontroly
do kyvet G1+G2.
4c. Napipetujte vždy dvakrát 100 µl naředěného
vzorku séra do dalších kyvet.
5. Přikryjte mikrotitrační destičku fólií a nechejte
inkubovat 2 hodiny (± 5 min) při teplotě 2-8°C.
6. Odstraňte fólii. Vyprázdněte kyvety a vymyjte je
chlazeným promývacím pufrem, a to čtyřikrát,
vždy nejméně 300 µl na každou kyvetu.
Vyprázdněte kyvety a důkladně vysušte
vyklepáním na savý papír.
7. Do všech kyvet přidejte 100 µl enzymového
markeru IgM.
Revision date: 2006-07-27 8/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISAVÝSLEDKY Standardizace
Kalibrační křivka Kalibrátory soupravy anti-MAG ELISA firmy
• Pro všechny kalibrátory změřte absorbanci při 450 BÜHLMANN byly kalibrovány vůči internímu
nm. referenčnímu materiálu. Referenční materiál se skládá
• Vypočítejte průměr z duplikovaných hodnot z více než 10 vzorků lidského séra obsahujících nízké,
absorbancí kalibrátorů. střední resp. vysoké titry protilátek proti MAG. Titry a
• Vyznačte průměrné hodnoty absorbance kalibrátorů specificita každého séra v referenčním materiálu byly
(svislá osa y) proti BTU (viz následující kapitola) analyzovány imunobloty Anti-MAG.
kalibrátorů (vodorovná osa x) s použitím Titrační jednotky Bühlmann (BTU) byly stanoveny
semilogaritmického papíru. následujícím způsobem:
• Zakreslete kalibrační křivku nebo vypočítejte • Vzorky normálních dárců byly analyzovány
spline-funkci s použitím algoritmu „spline smoothed metodou anti-MAG ELISA.
fitting“. • Sériově ředěné vzorky interního referenčního
Vzorky a kontroly materiálu byly stanoveny v jednom měření.
• Pro každou kyvetu se vzorkem a kontrolou změřte • Ředění, při němž je hodnota příslušného
absorbanci při 450 nm. referenčního vzorku již pod hodnotou cut-off
• Vypočítejte průměr z duplikovaných hodnot. stanovenou předtím na základě normálních vzorků,
• Koncentraci ve vzorku zjistíte pomocí kalibrační odpovídá titru referenčního vzorku v jednotkách
křivky . BTU.
POZNÁMKA: Jestliže fotometr není schopen POZNÁMKA: Titr séra závisí na použité metodě a
detekovat absorbanci vyšší než 2 nebo vyšší než je zvláště na specificitě a hodnotě cut-off stanovené pro
absorbance nejvyššího kalibrátoru , doporučujeme danou metodu. Nelze proto vzájemně porovnávat
provést další měření při vlnové délce 490 nebo 492 hodnoty titru získané s použitím různých metod.
nm (případný referenční filtr při 600 nebo 620 nm).
V takovémto případě musíte vytvořit druhou kalibrační KONTROLA KVALITY
křivku s absorbancí všech kalibrátorů při 490 nebo 492 Pro správné použití výrobku je nezbytné prostudování
nm. Koncentrace vzorků, které při 450 nm byly mimo tohoto příbalového letáku. Spolehlivé výsledky získáte
rozmezí, se pak stanovují z této nové kalibrační křivky. pouze při dodržení přesných laboratorních postupů
Hodnoty stanovené při 490 nebo 492 nm nenahrazují (běžné směrnice GLP – dobrá laboratorní praxe) a
hodnoty ostatních vzorků stanovené při 450 nm. přesným dodržením tohoto návodu.
Příklady výsledků a kalibrační křivky (viz Protože na trhu není běžně dostupné kontrolní sérum
Table 11 a Figure 1) pro protilátky proti MAG, doporučujeme pro interní
Uvedené výsledky a kalibrační křivka slouží pouze kontrolu kvality použít pozitivní směsná séra.
jako příklad. Kalibrační křivku je nutné vytvořit pro Výsledky všech naměřených kontrol musí být
každou sadu měřených vzorků. v předepsaných rozmezích. Limity spolehlivosti
kontrol jsou specifické pro šarži a najdete je vždy
HODNOTY CUT-OFF A STANDARDIZACE v příbalovém letáku kontrol.
Výskyt protilátek proti MAG v normálním lidském Reprodukovatelnost parametrů kalibrační křivky a
séru byl zjišťován na vzorcích krve od výsledků kontrol musí být v rámci stanovených limitů
asymptomatických dobrovolných dárců krve (dospělí přijatelnosti pro laboratoř. Jestliže přesnost stanovení
muži i ženy ve věku 18 až 70 let). Touto metodou bylo neodpovídá stanoveným limitům a opakované měření
změřeno 150 vzorků a výsledky jsou uvedeny v Table vyloučí technickou závadu, je nutné zkontrolovat
12. následující: i) pipetování, přístroje měřící teplotu a
POZNÁMKA: Tyto rozsahy titru slouží pouze čas, ii) kalibrace fotometru, iii) expirace reagencií, iv)
jako informativní hodnoty. Doporučujeme, aby si podmínky skladování a inkubace, v) substrát TMB
každá laboratoř vytvořila svá vlastní rozmezí, která musí být bezbarvý, vi) čistota vody.
odpovídají místní populaci.
Doporučená hodnota cut off ZNAKY METODY
Střední hodnota + 3SD udává jako technický cut-off Přesnost v rámci stanovení: 6,5%. Přesnost v rámci
hodnotu 729 BTU. Z praktických důvodů stanovení byla vypočítána z výsledků 20 dvojic
doporučujeme použít jako HODNOTU CUT-OFF 1000 hodnot získaných z jednoho měření (viz Table 13).
BTU jako pozitivní koncentraci, která odpovídá
Přesnost mezi stanoveními : 15,4%. Přesnost mezi
nejnižšímu kalibrátoru (= Kalibrátor D) v kalibrační
stanoveními byla vypočítána z 20 dvojic výsledků 20
křivce.
různých měření (viz Table 14).
Linearita ředění: 147%. 7 vzorků lidského séra
obsahujících vysoký titr protilátek proti MAG bylo
Revision date: 2006-07-27 9/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISAnaředěno inkubačním pufrem v poměru 1:1001 až metody ELISA bylo negativních i při stanovení
1:64001, ponecháno 1 hodinu při teplotě 18-28°C a metodou imunoblot a 1 sérum bylo mírně pozitivní
poté změřeno (viz. Table 15). Předpokládáme, že pouze u metody imunoblot (F. Ferracin a A.J. Steck,
poměrně vysoké odchylky vzorků (přibližně 50%) nepublikované výsledky).
jsou způsobeny agregací protilátek. Patologická séra 4. SROVNÁNÍ S NEPŘÍMÝM IMUNOFLUORESCENČNÍM
obecně vykazují silně zvýšené titry autoprotilátek, STANOVENÍM (IFA): Vzorky séra 150 pacientů
tento jev nemá tedy žádný vliv na rozhodování (neznámého pohlaví a věku) s diagnózou IgM
pozitivní/negativní. monoklonální gamapatie byly testovány metodou
Analytická senzitivita: 444 BTU. Bylo stanoveno 20 ELISA a IFA. Při stanovení IFA se vzorky
dvojic inkubačního pufru v jednom měření. Pro inkubovaly na zmražených a acetonem fixovaných
hodnoty absorbancí byla vypočítána střední hodnota a řezech opičího sedacího nervu a navázané
standardní odchylka. Minimální zjistitelné množství autoprotilátky proti MAG byly detekovány
protilátek proti MAG bylo stanoveno na 444 BTU tak, protilátkou proti lidskému IgM značenou FITC. 26
že ke střední hodnotě absorbance se přičetl vzorků (17,3%) bylo pozitivních a 115 vzorků
dvojnásobek standardní odchylky a výsledná hodnota (76,7%) negativních u obou metod, přičemž 5 vzorků
se odečetla přes kalibrační křivku stanovenou pro toto (3,3%) bylo pozitivních pouze u metody IFA a 4
měření. vzorky (2,7%) byly pozitivní pouze u metody ELISA
(3).
Funkční senzitivita: 900 BTU. Bylo stanoveno 20
dvojic protilátek proti MAG s nízkým titrem. Pro
hodnoty absorbancí se vypočítala střední hodnota, DEUTSCH
standardní odchylka (SD) a variační koeficient (CV). ANWENDUNGSZWECK
Zjistili jsme, že CV menší než 10% je u titru 900 Der BÜHLMANN anti-MAG ELISA wird gebraucht
BTU. für die direkte und quantitative in vitro diagnostische
Specificita: Pro zjištění specificity soupravy anti- Bestimmung von IgM-Autoantikörpern gegen das
MAG ELISA firmy BÜHLMANN byly provedeny Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG)(1,2).
čtyři testy:
1. NEUTRALIZACE AUTOPROTILÁTEK PROTI MAG: U PRINZIP DER METHODE
pěti vzorků séra s vysokým titrem MAG byla, Der vorliegende anti-MAG Autoantikörper ELISA Test ist
v závislosti na koncentraci, inhibována vazba na ein immunometrischer Festphasen-Enzymimmunoassay.
Die Mikrotiter-Platte ist mit HOCHGEREINIGTEM HUMANEM
mikrotitrační destičku po jednohodinové inkubaci MAG Antigen beschichtet mit höchster Spezifität und
v inkubačním pufru s přídavkem 1 až 200µg/ml MAG Sensitivität. Standards, Kontrolle und Patientenproben
před testováním metodou ELISA. werden in die Antigen beschichtete Mikrotiter-Platte
2. SPECIFICITA VAZBY AUTOPROTILÁTKY PROTI MAG: pipettiert. In der Probe vorhandene Autoantikörper binden
Pět vzorků séra se středním až vysokým titrem während der ersten 2-stündigen Inkubation (2-8°C) an das
in der Mikrotiter-Platte immobilisierte MAG. Nicht
autoprotilátky proti MAG a pět negativních vzorků gebundene Serumkomponenten werden durch einen
séra bylo testováno metodou GanglioCombi (EK- Waschschritt entfernt. Anschliessend wird ein, gegen die
GCO) na destičce potažené asialo-GM1, GM1, GM2, nachzuweisenden Autoantikörper gerichtetes, Anti-human-
GD1a, GD1b a GQ1b. Žádný ze vzorků nevykázal IgM-Meerrettichperoxidase (anti-IgM-HRP) Konjugat in die
poměr vyšší než 10% (poměr cut-off >12%). Podobně Mikroküvetten der Mikrotiter-Platten pipettiert. An die
immobilisierten Antigene gebundene Autoantikörper
bylo testováno šest vzorků séra s vysokým titrem werden während der folgenden 2-stündigen Inkubation (2-
protilátek proti gangliosidu (viz výše) a pět negativních 8°C) von diesem enzymmarkierten Tracer-Antikörpern
vzorků séra na destičce potažené MAG. Žádný z těchto spezifisch erkannt und durch Ausbildung eines Sandwich-
patologických vzorků nevykázal signál vyšší než 300 Komplexes markiert. Ungebundenes Enzymkonjugat wird
BTU. durch erneutes Waschen eliminiert. Das zugegebene
Substrat, Tetramethylbenzidin (TMB) wird anschliessend
3. SROVNÁNÍ S METODOU IMUNOBLOT (WESTERN BLOT): vom gebundenen Enzym zu einem blauen Endprodukt
127 vzorků pacientů (40 žen; 87 mužů; věk 4-90 let) umgesetzt. Die Enzymreaktion wird nach 30 Minuten durch
s neurologickými potížemi, jejichž předpokládanou Zugabe einer sauren Stop-Lösung (H2SO4) beendet,
příčinou byly autoprotilátky proti MAG, bylo welche die Färbung nach gelb umschlagen lässt. Die bei
testováno metodou ELISA resp. western blot. U obou einer Wellenlänge von 450 nm gemessene optische Dichte
der Lösung ist der Konzentration Autoantikörper in den
metod byl použit MAG izolovaný z lidského Proben direkt proportional. Ein Set von human anti-MAG
centrálního nervového (CNS). Všech 12 vzorků séra Autoantikörper Kalibratoren wird gebraucht um eine
se středním až velmi vysokým titrem IgM Standardkurve zu erstellen. Daraus lässt sich die
autoprotilátek proti MAG stanoveným metodou Antikörper Konzentration aus einer unbekannten Probe
ELISA bylo jednoznačně pozitivní i při metodě berechnen.
imunoblot. 114 ze 115 vzorků séra vykazujících titr GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG
Reagenz Inhalt Art.-Nr. Rekonstitution
IgM autoprotilátek proti MAG pod hranicí cut-off Mikrotiter-Platte 8 x 12 Micro- B-MAG-MP gebrauchsfertig
Revision date: 2006-07-27 10/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISAbeschichtet mit humanem MAG küvetten mit
Halter
Peroxid und Dimethylformamide. Die Stop-Lösung (B-
Abdeckfolien 3 Stück STS) enthält Schwefelsäure. Jeder dieser Reagenzien
mit 900 ml
Wasch-Puffer Konzentrat (10x)
Konservierungsstoffe
1 Flasche
100 ml
B-MAG-WB deionisiertem reizt die Augen, die Haut und die
Inkubations-Puffer 1 Flasche
H2O verdünnen
Schleimhautmembranen. Berührung mit den Augen,
B-MAG-IB gebrauchsfertig
Konservierungsstoffe 100 ml der Haut und die Bekleidung vermeiden.
Kalibrator A-D1 mit 1 ml
Humanserum; 4 Flaschen B-MAG-CASET Inkubations-
Konservierungstoffe Puffer versetzen
Kontrolle tief und hoch2
ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL
mit 1 ml
Humanserum 2 Flaschen B-MAG-CONSET Inkubations- • Präzisionspipetten für 2 µl, 100 µl und 1 ml.
Konservierungstoffe Puffer versetzen
Enzymmarker IgM • Polystyren oder Polypropylen Einwegröhrchen zur
Anti-IgM-HRP in einem Protein-
basierten Puffer
1 Flasche
11 ml
B-MAG-ELM
gebrauchsfertig
blaue Lösung
Vorbereitung der Verdünnungsproben.
Konservierungstoffe • 1000 ml Zylinder zur Verdünnung des
TMB-Substrat 1 Flasche
in Zitrat-gepufferter H2O2 Lösung 11 ml
B-TMB gebrauchsfertig Waschpuffers.
Stopp-Lösung 1 Flasche
B-STS
gebrauchsfertig • Microtiter-Platten-Waschgerät oder Spritzflasche für
0.25 M H2SO4 11 ml korrosiv!
Waschpuffer.
Table 3
1
Nach der Rekonstitution enthalten die Kalibratoren A, • Microtiter-Platten-Schüttler.
B, C und D 70000, 15000, 3000 und 1000 Bühlmann • Microtiter-Platten-Photometer mit optischem Filter
Titer Unit (BTU) anti-MAG Antikörper. (450 nm)
2
Kontrollen enthalten lot-spezifische anti-MAG Antikörper
Mengen. Für Konzentrationsangaben siehe beigelegtes UNTERSUCHUNGSMATERIAL UND LAGERUNG
Kontrolldatenblatt. Dieser Test benötigtZweimal 100 µl Kalibrator A in die Mikroküvetten • Eichkurve zeichnen oder die entsprechende
B1 und B2 pipettieren. geglättete Spline-Funktion mit einem „spline
Zweimal 100 µl Kalibrator B in die Mikroküvetten smoothed fitting“ Algorithmus berechnen.
C1 und C2 pipettieren. Proben und Kontrollen
Zweimal 100 µl Kalibrator C in die Mikroküvetten • Absorption bei 450 nm jeder Probe und Kontrollen
D1 und D2 pipettieren. aufschreiben.
Zweimal 100 µl Kalibrator D in die Mikroküvetten • Mittelwerte der Doppelbestimmungen berechnen.
E1 und E2 pipettieren. • Konzentration der unbekannten Proben durch
4b. Zweimal 100 µl Kontrolle TIEF in die Interpolation aus der Eichkurve bestimmen.
Mikroküvetten F1 und F2 pipettieren. HINWEIS: Falls das Microtiterplatten-Photometer
Zweimal 100 µl Kontrolle HOCH in die nicht fähig ist, Absorptionen grösser als 2 oder als die
Mikroküvetten G1 und G2 pipettieren. Absorption des höchsten Kalibrators zu messen, sollte
4c. Zweimal 100 µl von den Serumproben in die eine zweite Messung bei 490 oder 492 nm (mit 600
nächsten Mikroküvetten pipettieren. oder 620 nm-Referenzfilter, falls vorhanden)
5. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken durchgeführt werden. In diesem Fall sollte eine zweite
und Eichkurve aus den Absorptionsmessungen aller
2 Stunden (± 5 Minuten) bei 2-8°C inkubieren. Kalibratoren bei 490 oder 492 nm gebildet werden. Die
6. Abdeckfolie entsorgen und die Mikroküvetten Konzentration, der ausserhalb des Anzeigebereiches
entleeren und viermal mit jeweils ≥300 µl kaltem liegenden Proben, kann dann mit der neuen Eichkurve
Waschpuffer waschen. Platte durch Ausschlagen auf bestimmt werden. Die Messungen bei 490 oder 492
saugfähigem Papier sorgfältig trocknen. nm dürfen in keinem Fall die „on-scale“ Messungen
7. 100 µl Enzymmarker IgM zu jeder Mikroküvette bei 450 nm ersetzen.
zugeben. Resultat- und Eichkurvenbeispiel
8. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken Siehe Table 11 sowie Figure 1. Die Tabelle zeigt
und typische Messwerte für den anti-MAG Test. Die
2 Stunden (± 5 Minuten) bei 2-8°C inkubieren. Daten dienen nur der Illustration und sind nicht dazu
9. Abdeckfolie entsorgen und die Mikroküvetten bestimmt, die Ergebnisse eines anderen
Testenansatzes danach zu berechnen. Eine Eichkurve
entleeren und viermal mit jeweils ≥300 µl kaltem
muss für jeden Probensatz jeweils neu ermittelt
Waschpuffer waschen. Platte durch Ausschlagen auf
werden.
saugfähigem Papier sorgfältig trocknen.
Wichtig: TMB-Substrat auf 18-28°C erwärmen.
GRENZWERT (CUT-OFF) UND STANDARDISIERUNG
10. 100 µl TMB-Substrat zu jeder Mikroküvette Die Frequenz der Anti-MAG Autoantikörper in normalem
zugeben. Humanserum wurde mit Blutproben von asymptomatischen
11. Mikrotiter-Platte mit Abdeckfolie abdecken Blutspendern (männliche und weibliche Erwachsene von
und 30 Minuten (± 5 Minuten) bei 18-28°C auf 18 zu 70 Jahre alt) ermittelt. 150 Serumproben wurden
einem Mikrotiter-Platten-Schüttler (800-1000 rpm) entsprechend der Arbeitsanleitung untersucht und die in
Table 12 angegebene Ergebnisse wurden erhalten.
inkubieren. Platte vor direktem Licht schützen. HINWEIS: Die angegebenen Werte dienen nur als
12. 100 µl Stopp-Lösung zu jeder Mikroküvette Richtlinie. Es wird empfohlen, dass jedes Labor eigene zu
zugeben und allfällige Luftblässchen mit erwartende Normalbereiche ermittelt, welche auf ihre
Pipettenspitzen entfernen. Patientenpopulation zutreffen.
13. Optische Dichte bei 450 nm innerhalb der Vorgeschlagener Grenzwert (Cut-Off)
Der Mittelwert + 3 Standardabweichungen [SD] ergibt einen
nächsten technischen Cut-Off von 729 BTU. Aus praktischen Gründen
30 Minuten messen. Bi-chromatische Messung mit wird den GRENZWERT VON 1000 BTU als positive Cut-Off-
einer Referenzfilterwellenlänge im Bereich von Konzentration empfohlen, der zum untersten Standard der
600-620 nm ist empfehlenswert. Eichkurve (Kalibrator D) korrespondiert.
Standardisierung
RESULTATE Mangels einer internationalen Referenzpräparation
Eichkurve wurde der Assay gegen interne Referenzen (zehn
• Absorption bei 450 nm von jedem Kalibrator individuelle Humanseren mit niedrigem, mittlerem
aufschreiben. und hohem Anti-MAG Autoantikörper-Titer)
• Mittelwerte der Doppelbestimmung der kalibriert. Die Spezifizität und der
gemessenen Kalibrator-Absorptionen berechnen. Autoantikörpergehalt dieser Proben, wurde zuvor
• Auf halblogarithmischem Papier, die Absorptions- mittels eines Anti-MAG Immunoblots charakterisiert.
Mittelwerte der Kalibratoren (Y-Achse/linear) gegen Die Definition der Bühlmann Titer Units (BTU)
die in BTU (siehe unten) gegebenen Konzentrationen lautet wie folgt:
(X-Achse/ logarithmisch) auftragen.
Revision date: 2006-07-27 12/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISA• Der Antikörpergehalt in Proben normaler mit Inkubations-Puffer 1:1000 bis 1:64000 verdünnt,
Blutspender wurde im Anti-MAG Test entsprechend für eine Stunde bei 18-28°C stehen gelassen und
der Arbeitsanleitung bestimmt. danach entsprechend der Arbeitsanleitung getestet
• Lineare Verdünnungsreihen der Proben des internen (siehe Table 15). Es wird vermutet, dass die relativ
Referenzpools wurden in demselben Testansatz hohen Abweichungen, in ungefähr 50% der Proben,
mitbestimmt. aufgrund von Antikörper Aggregaten zustande
• Die Verdünnung, bei der die jeweilige kommt. Im Allgemeinen enthalten aber pathologische
Referenzprobe unter den zuvor auf der Basis der Seren sehr hohe Autoantikörper Titer, sodass dies
Normalproben errechneten Cut-Off fällt, entspricht keinen Einfluss auf die positiv/negativ Diskrimination
dann dem Titer der Referenzprobe in Bühlmann Titer hat.
Units.
Analytische Sensitivität: 444 BTU. 20
HINWEIS: Die für die Anti-MAG ermittelten
Doppelansätze mit Inkubations-Puffer wurden gleich-
Serumtiter sind abhängig von der verwendeten
zeitig angesetzt. Mittelwert und Standardabweichung
Methode und daher nicht direkt untereinander
wurden für die Absorbtionswerte berechnet. Die
vergleichbar. Für longitudinale Studien können nur
kleinste nachweisbare Menge für anti-MAG
solche Ergebnisse miteinander verglichen werden, die
Autoantikörper wurde durch Addition von zwei
mit derselben Methode ermittelt wurden.
Standardabweichungen zum Mittelwert der
Absorption berechnet. Die Intersektion dieses Wertes
QUALITÄTSKONTROLLE
Ein vollständiges Verständnis dieser mit der Standardkurve ergab einen Wert von 444
Testpackungsbeilage ist für den erfolgreichen BTU.
Gebrauch des Produktes notwendig. Zuverlässige Funktionelle Sensitivät: 900 BTU. 20 Doppelansätze
Resultate werden nur erreicht, durch die Anwendung von Proben mit tiefen anti-MAG Autoantikörpern
„Guter Laborpraxis“ (aktuelle GLP Richtlinien) und wurden gleichzeitig angesetzt. Mittelwert,
die Einhaltung der Arbeitsanleitung. Standardabweichung (SD) und Variationskoeffizient
Da es keine kommerziell erhältliche Anti-MAG (CV) wurde von den Absorptionswerten berechnet.
Autoantikörper Kontrolle gibt, wird empfohlen, Einen CV von 10% wurde bei einem Titer von 900
positive Serumproben als interne Qualitätskontrolle BTU erreicht.
anzuwenden. Spezifizität: Vier Versuchsansätze wurden
Alle Kontrollen müssen im etablierten durchgeführt, um die Spezifizität des BÜHLMANN
Vertrauensbereich liegen. Die Vertrauensbereiche der anti-MAG ELISA Testes zu ermitteln:
Kontrollen sind Lot-spezifisch und sind auf dem 1. NEUTRALISIERUNG DER ANTI-MAG-
zusätzlichen Kontrollblatt angegeben. AUTOANTIKÖRPER: Die Bindung zwischen der mit
Die Reproduzierbarkeit der Eichkurvenparameter und MAG beschichteten Microtiter-Platte und 5 Seren mit
der Kontrollwerte sollte innerhalb des etablierten hohen anti-MAG Antikörper-Spiegel, wurde durch eine
Erwartungs-bereiches liegen. Falls die Präzision des einstündige Vorinkubation mit 1 to 200 µg/ml MAG
Testes nicht mit dem etablierten Erwartungsbereich und Inkubations-Puffer vor dem eigentlichen Test mit
übereinstimmt und wiederholte Messungen ein der ELISA Methode, konzentrationsabhängig
technisches Problem ausschliessen, sind folgende gehemmt.
Bedingungen zu überprüfen: i) Pipettierung, 2. SPEZIFITÄT DER ANTI-MAG AUTOANTIKÖRPER
Temperatur- und Zeitmessende Geräte, ii) Photometer BINDUNG: Fünf Seren mit mittleren bis hohen anti-
Eichung, iii) Verfallsdaten der Reagenzien, iv) MAG Autoantikörper Titern sowie fünf negative
Lagerung- und Inkubations-Bedingungen, v) die TMB Seren wurden auf einer GanglioCombi (EK-GCO)
Substratlösung sollte farblos sein, vi) Wasserreinheit. Microtiter-Platte getestet welche mit den folgenden
Gangliosiden beschichtet sind: asialo-GM1, GM1,
LEISTUNGSMERKMALE GM2, GD1a, GD1b und GQ1b. Keine der Proben
Intra-Assay Präzision (Within-Run): 6.5%. Die zeigte ein Verhältnis (Ratio) welches grösser als 10%
intra-assay Präzision wurde bestimmt durch die 20- war (Cut-Off Ratio >12%). Auf ähnliche Weise
fache Doppelmessung im gleichen Ansatz (siehe Table wurden sechs Seren mit hohen anti-Ganglioside
13). Autoantikörper Titer (siehe oben), sowie fünf negative
Inter-Assay Präzision (Run-to-Run): 15.4%. Die Seren auf MAG beschichteten Microtiter-Platten
inter-assay Präzision wurde bestimmt durch die 20- getestet. Keines dieser pathologischen Seren ergab ein
fache Doppelmessung in 20 verschiedenen Ansätzen Signal, das höher als 300 BTU war.
(siehe Table 14). 3. VERGLEICH MIT DER IMMUNOBLOT METHODE
Verdünnungslinearität: 147%. Sieben Serumproben (WESTERN BLOT): 127 Seren von Patienten (40
mit erhöhten anti-MAG Autoantikörper Titer wurden weibliche, 87 männliche, Alter 4-90 Jahren) mit
vermutlich anti-MAG verursachten neurologischen
Revision date: 2006-07-27 13/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISAKrankheiten wurden mit dem ELISA Test und einer FRANCAIS
Immunoblot-Methode untersucht. In beiden Methoden DOMAINE D’UTILISATION
wurde aus humanem Zentral-Nervensystem isoliertes La trousse BÜHLMANN anti-MAG ELISA a été
MAG eingesetzt. Alle 12 Seren, die mit der ELISA conçue pour la détermination diagnostique
Methode mittelhohe bis sehr hohe anti-MAG- quantitative in vitro des auto-anticorps IgM humains
Autoantikörper Werte zeigten, waren auch mit der dirigés contre la glycoprotéine associée à la myéline
Immunoblot Methode deutlich positiv. Von den 115 (MAG) (1,2).
Proben, die einen anti-MAG-Autoantikörper-Spiegel
unter dem Grenzwert (Cut-Off) der ELISA Methode PRINCIPE DU DOSAGE
hatten, sind auch 114 mit Immunoblot negativ getestet Le test de dosage des autoanticorps anti-MAG ELISA
worden. Ein Serum war leicht positiv mit der repose sur la technique d’amplification enzymatique
Immunoblot Methode (F. Ferracin and A.J. Steck, quantitative de type “sandwich”. Une microplaque
pers. Kommunkation). précoatée de MAG de cerveau humain hautement
4. VERGLEICH MIT DER IFA (INDIRECT purifiée est utilisée. Les calibrateurs et les échantillons
IMMUNOFLUORESCENCE ASSAY) METHODE: Es wurden sériques sont incubés pendant 2 heures dans les puits
150 Serumproben von Patienten (Geschlecht und de microplaque. Au cours de cette incubation, les
Alter unbekannt) mit diagnostizierter IgM auto-anticorps anti-MAG sont liés par la MAG
monoklonaler Gammopathie mit Hilfe der ELISA- humaine coatée. Après lavage des molécules non-
und einer IFA-Methode getestet. In der IFA Methode liées, un anticorps dirigé contre les IgM humaines
wurden Seren mit gefrorenen und Azeton-fixierten marqué avec la peroxydase de raifort (anti-IgM-HRP)
Querschnitten von Affen Ischiasnerven inkubiert. est ajouté dans les puits. La microplaque est incubée
Gebundene anti-MAG Antikörper wurden dann pendant 2 heures supplémentaires. Après élimination
mittels anti-human-IgM Autoantikörper ermittelt. 26 par lavage des anticorps marqués non-liés, la solution
Proben (17.3%) waren mit beiden Methoden positiv contenant le substrat tétraméthylbenzidine (TMB) est
getestet. 115 Patienten (76.7%) waren mit beiden ajoutée dans les puits. La microplaque est incubée
Methoden negativ. 5 Proben (3.3%) sind nur mit der pendant 30 minutes. Une coloration bleue se
IFA Methode und 4 Proben (2.7%) nur mit der ELISA développe proportionnellement à la quantité d’auto-
Methode positiv getestet worden (3). anticorps anti-MAG liés lors de l’étape initiale. La
réaction de coloration est stoppée par l’addition d’une
solution stop acide (H2SO4) faisant passer la couleur
du bleu au jaune. L’intensité de la coloration est
déterminée par mesure de l’absorbance à 450 nm dans
un lecteur de microplaques. L’absorbance mesurée est
directement proportionnelle à la concentration d’auto-
anticorps anti-MAG présente dans chaque échantillon.
Les concentrations inconnues d’auto-anticorps anti-
MAG humaine des échantillons sont déterminées à
l’aide d’une courbe d’étalonnage obtenue au moyen
des calibrateurs livrés dans la trousse.
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION
Réactifs Quantité Code Reconstitution
12 barrettes
Microplaque
de 8 puits + B-MAG-MP Prête à l’emploi
96 puits, précoatée-MAG
support
Film adhésif 3
Tampon de lavage concentré
1 flacon A reconstituer avec 900
(10x) B-MAG-WB
100 ml ml d’eau déionisée
avec conservateurs
Tampon d’incubation 1 flacon
B-MAG-IB Prêt à l’emploi
avec conservateurs 100 ml
1
Calibrateurs A à D A reconstituer avec 1
sérum humain avec 4 flacons B-MAG-CASET ml de tampon
conservateurs d’incubation
2
Contrôles élevé et bas A reconstituer avec 1
sérum humain avec 2 flacons B-MAG-CONSET ml de tampon
conservateurs d’incubation
Marqueur Enzymatique
IgM 1 flacon Prêt à l’emploi
B-MAG-ELM
anti-IgM-HRP avec 11 ml Solution bleue
conservateurs
Substrat TMB
1 flacon
TMB en tampon citrate + B-TMB Prêt à l’emploi
11 ml
H2O2
Solution Stop 1 flacon Prêt à l’emploi
B- STS
0.25 M H2SO4 11 ml Corrosif
Revision date: 2006-07-27 14/32 BÜHLMANN anti-MAG ELISAYou can also read
