Direct Saliva MELATONIN - ELISA - novolytix
←
→
Page content transcription
If your browser does not render page correctly, please read the page content below
Direct Saliva MELATONIN
ELISA
EK-DSM 96 tests
Release Date: 2021-05-07
NovoLytiX GmbH English page 2
Benkenstrasse 254C Deutsch Seite 6
CH - 4108 Witterswil / Switzerland
Français page 10
Tel.: +41 61 721 01 00
Fax: +41 61 530 11 06 Italiano pagina 14
support@novolytix.ch Español página 18ENGLISH buffered with citrate 11 mL
Reagents Quantity Code Reconstitution
INTENDED USE Stop Solution Ready to use
1 vial
0.25 M sulfuric acid B-STS corrosive
The NovoLytiX Direct Saliva Melatonin ELISA (EK-DSM) is 11 mL
(H2SO4) agent
intended for highly sensitive, quantitative determination of
melatonin in human saliva (1-4). Table 1
1)
The Blanking reagent contains a saturated melatonin solution. Prevent any
contamination of other kit reagents.
PRINCIPLE OF THE ASSAY 2)
The Calibrators A, B, C, D and E contain the following melatonin
concentration: 0.48, 1.2, 3.2, 8.0 and 20 pg/mL which are corrected for the
The BÜHLMANN Direct Saliva Melatonin ELISA is a 20% sample dilution during pretreatment and therefore, labeled with 0.6,
competitive immunoassay using a capture antibody (Ab) 1.5, 4.0, 10, and 25 pg/mL of melatonin, respectively.
3)
technique. The polyclonal Kennaway G280 anti-melatonin Lot specific amount of melatonin see data sheet added to the kit.
antibody (5, 6) has been coated onto the microtiter plate,
provided in the kit. After the first 16-20-hours overnight STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS
incubation, melatonin present in the pre-treated saliva and Sealed / Unopened Reagents
controls as well as in the calibrators, compete with biotinylated
Store at 2-8°C until expiration date. Do not use past expiration date.
melatonin during a 3-hours incubation for the binding sites of
Opened / Reconstituted Reagents
this highly specific antibody. After washing, the enzyme label
streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) is Return unused strips immediately to the plastic
pouch containing the desiccant pack and reseal
added, which binds to the melatonin-biotin-antibody Microtiter Plate
along the entire edge of zip-seal. Store for up to 2
complexes captured on the coated wells during a 60-minutes months at 2-8°C
incubation step. Unbound enzyme label is then removed by a Pretreatment
washing step and TMB substrate (tetramethylbenzidine) is Reagent
Store at 2-8°C until expiration date printed on the
added to the wells. In a further 30-minutes incubation step, a Neutralizing Solution labels.
chromophore is formed in inverse proportion to the amount of Incubation Buffer
melatonin present in the sample. The color turns from blue to
Wash Buffer diluted Store at 2-8°C up to 6 months
yellow after the addition of an acidic stop solution and can be
measured at 450 nm. Blanking Reagent
Calibrators Stable at 2-8°C up to 4 months.
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION Controls
Biotin Conjugate
Reagents Quantity Code Reconstitution
Ready to use Enzyme Label Store at 2-8 °C until expiration date printed on the
Pretreatment 1 vial
B-EKDSM-PRS corrosive TMB Substrate labels.
Solution 5 mL
agent
Stop Solution
1 vial Ready to use
Neutralizing Solution B-EKDSM-NS
5 mL irritant Table 2
Microtiter Plate
Wash 2x before
precoated with G280 12x8 wells B-EKDSM-MP MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
use
anti-melatonin Ab
Plate Sealer
• Precision pipettes with disposable tips: 5 µL, 50 µL,
3 pieces - Ready to use
100 µL and 1000 µL pipettes. Repeater or multichannel
Wash Buffer Dilute with
Concentrate (10x)
1 bottle pipette for 50 µL and 100 µL.
B-EKDSM-WB 900 mL
100 mL
with preservatives deionized water • Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the
Blanking Reagent1) Reconstitute in preparation of sample dilutions.
1 vial
50 µL concentrate; do B-EKDSM-BR 1mL Incubation • 1000 mL cylinder for the dilution of the wash buffer.
not pretreat Buffer
• Microtiter plate washer or squeeze bottle for wash
Incubation Buffer
1 vial buffer.
(Zero Calibrator) B-EKDSM-IB Ready to use
12 mL • Blotting paper.
melatonin-free buffer
Reconstitute
• Refrigerator
Calibrators2)
5 vials B-EKDSM- each with 1 mL • Microtiter plate orbital shaker.
50 µL concentrate; do CASET Incubation
not pretreat Buffer • Microtiter plate reader for measurement of absorbance
Control low / high 3) at 450 nm.
Reconstitute
50 µL concentrate; for
2 vials B-EKDSM- each with 1 mL • NovoLytiX Saliva Collection Devices, B-SLEEP-
pretreatment see CONSET Incubation CHECK16 or B-SVC50.
page 3 Buffer
1 vial
Biotin Conjugate B-EKDSM-BC Ready to use PRECAUTIONS
5.5 mL
Enzyme Label
Safety precautions
1 vial
Streptavidin B-EKDSM-EL Ready to use • This test is for in vitro use only, and must be handled by
11 mL
conjugated to HRP qualified personnel, in accordance with good laboratory
TMB Substrate 1 vial B-TMB Ready to use practices (GLP).
Release date: 2021-05-07 2/28 Direct Saliva Melatonin ELISA• Pretreatment/ neutralizing solution, substrate and stop SPECIMEN SHIPMENT AND STORAGE
solution: The pretreatment solution (B-EKDSM-PRS)
contains sodium hydroxide (NaOH) and the neutralizing Shipment: The collected saliva samples must be shipped to
solution (B-EKDSM-NS) contains hydrochloric acid the laboratory within two days. Collected saliva samples must
(HCl). The substrate TMB (B-TMB) contains be kept in the fridge at 2-8°C.
Tetramethylbenzidine. The stop solution (B-STS) Samples should not be sent on Fridays, Saturdays or the day
contains sulfuric acid (0.25 M). Each of those reagents before holiday.
is irritant to eyes, skin and mucous membranes. Avoid Storage: The saliva samples absorbed in the cotton swab
contact with eyes, skin and clothes Wear suitable may be stored in the saliva collection device for up to 7 days
protective clothing, gloves and eye protection. After at 2-8°C. If not assayed within one week after collection,
contact with eyes or skin, wash immediately with plenty samples should be frozen and may be stored for at least 6
of water. months at ≤ -20°C. Repeated freeze-thaw cycles should be
• Unused solution should be disposed of according to avoided.
local state and federal regulations.
SPECIMEN COLLECTION
Technical precautions
Collect saliva using the NovoLytiX Saliva Collection Devices.
Kit components The devices can absorb up to 3 mL of saliva. The procedure
• Read the instructions carefully before carrying out the calls for 0.2 mL of saliva.
test. Test performance will be adversely affected if • Do not use cotton swabs containing citric acid.
reagents are incorrectly diluted, modified or stored
under conditions other than those as detailed in this • Do not stimulate saliva flow by chewing gums or eating
instruction for use. lemons.
• NEW: The Blanking Reagent (B-EKDSM-BR), the • Patients should perform the collection on an evening
Calibrators A to E (B-EKDSM-CASET) and the Controls without sporting activities and any intense efforts.
(B-EKDSM-CONSET) are provided as a concentrate • When collecting saliva at night, a dim flash light or a ≤100
and are replacing the lyophilized form. After adding 1 mL lux yellow light should be used in order to avoid a
of Incubation Buffer (B-EKDSM-IB) the vials should be possible light influence on the melatonin profile.
gently shaken und turned a few times over the tightly • Nothing should be eaten during the collection time. The
screwed cap in order to reconstitute potentially last meal must be taken at least 30 minutes before
remaining drops attached to the vial walls and sealing starting the collection. Bananas and chocolate should not
caps. be eaten during the entire day before the collection.
• Residues in the microtiter plate wells result from the Rinse the mouth with water 15 minutes before the
production process. They are removed in the washing collection.
step (assay procedure step 2) and do not affect the • Drinks containing artificial colorants, caffeine (coffee,
results. black or green tea, iced tea, cola) or alcohol are to be
• Components must not be used after the expiry date avoided on the evening of the collection.
printed on the labels. • Patients should avoid brushing their teeth, with or without
• Do not mix different lots of reagents. toothpaste, during sampling periods. It is likely that
• Every effort should be made to ensure that no cross patients with gingivitis will contaminate the saliva with
contamination occurs between reagents, samples or plasma or even whole blood leading to unknown
between wells. consequences.
• Microwells cannot be re-used. • On the collection day, if possible, no aspirin and
medicines that contain ibuprofen (Brufen®, Algifor®
• Let the reagents adjust to reach room temperature. Mix Dismenol®, Dolocyl®, Ecoprofen®) should be taken. If
the reagents well (vortex) before use. your sleep or sleep-wake rhythm is treated with
Assay procedure melatonin, this must be discontinued at least one week
before the collection.
• The blanking reagent contains a saturated melatonin
solution. Avoid any contamination of other reagents of
this kit. Change disposable tips after each pipetting step. SAMPLE PRETREATMENT (LABORATORY)
• The assay procedure has been optimized for Sleep
Sample recovery from saliva collection devices
Check application. Therefore blank reagent and
calibrators are assayed in duplicates, whereas controls Centrifuge the collection devices sent by the patient for
and patient samples are measured in single around 5 min at 3000 rpm (~1500x g). Discard the
suspended insert with the swab and store the tube at 2-8°C
determinations. This approach allows you to test 16
or -20°C.
individual profiles (with 5 points each) per microtiter
plate. For applications other than Sleep Check duplicate Pre-treatment of saliva samples and controls
determinations are recommended. • Pipet 200 µL of controls and saliva samples,
respectively, into correspondingly marked
polypropylene tubes.
• Add 25 µL of pretreatment solution to each tube using a
multichannel or repeater pipette.
Release date: 2021-05-07 3/28 Direct Saliva Melatonin ELISA• Vortex for 5 seconds and leave the tubes for 10 minutes 14. Read the absorbance at 450 nm in a microtiter plate
at 18-28 °C. reader.
• Add 25 µL of neutralizing solution to each tube using a
multichannel or repeater pipette. Vortex for 5 seconds. QUALITY CONTROL
• Centrifuge the pre-treated samples for 5 minutes at A thorough understanding of this instruction for use is
10’000 rpm. Proceed to the ELISA procedure. necessary for the successful use of the product. Reliable
results will be obtained only by by precise laboratory
ASSAY PROCEDURE techniques (current GLP guidelines) and accurately
following this instruction for use.
1. Use a plate with enough 8-well strips to test the desired Since there are no controls for saliva melatonin
number of blanks, calibrators, controls and samples. commercially available, we recommend using saliva pools
Remove excess strips from the holder and re-seal them containing different levels of melatonin for internal quality
in the foil pouch together with the two desiccant bags controls. The reproducibility of standard curve parameters
without delay. Store refrigerated. and control values should be within established limits of
2. Wash the coated strips twice using at least 300 µL of laboratory acceptability. The confidence limits for the
Wash Buffer per well. Empty the wells and strike the plate controls are lot-specific and printed on the additional QC
firmly onto blotting paper. data sheet.
3a.Pipet 100 µL of blanking reagent (blank) in duplicate into If the performance of the assay does not meet the
wells A1+A2. established limits and repetition has excluded errors in
3b.Pipet 100 µL of incubation buffer (zero calibrator) in technique, check the following issues: i) pipeting,
temperature controlling and timing devices ii) ELISA reader
duplicate into wells B1+B2.
settings iii) expiration dates of reagents iv) storage and
3c.Pipet 100 µL of calibrator A in duplicate into wells C1+C2 incubation conditions v) TMB substrate solution should be
Pipet 100 µL of calibrator B in duplicate into wells D1+D2 colorless and vi) purity of water.
Pipet 100 µL of calibrator C in duplicate into wells E1+E2
Pipet 100 µL of calibrator D in duplicate into wells F1+F2 STANDARDIZATION
Pipet 100 µL of calibrator E in duplicate into wells G1+G2 Direct Saliva Melatonin ELISA is calibrated with UV/VIS: Ɛ278
3d.Pipet 100 µL of pretreated low control into well H1 = 6300 M-1cm-1 in methanol.
Pipet 100 µL of pretreated high control into well H2
RESULTS
3e.Pipet 100 µL of each pretreated sample (single) into the
subsequent wells. Standard Curve
4. Cover the plate with a plate sealer, place it for 1 min on a Record the absorbance at 450 nm for each calibrator,
plate orbital shaker set at 600 rpm and then incubate for incubation buffer and blank well. Average the duplicate
16-20 hours at 2-8 °C. values, subtract the average of the blank wells and record
averages (=corrected average absorbance). Calculate the
5. Remove and discard plate sealer. Add 50 µL of biotin
binding (B) of each pair of calibrator wells as a percent of
conjugate (blue solution) to each well. Cover the plate incubation buffer (B0), with the blank-corrected absorbance
with a plate sealer and place it for 1 min on a plate orbital of the incubation buffer taken as 100 %.
shaker set at 600 rpm.
6. Incubate for 3 hours (±5 minutes) at 2-8 °C. net absorbance
B/ BO (%) = percent bound = x 100
7. Remove and discard the plate sealer. Aspirate or invert the net absorbance of incubation buffer
plate to empty the solution from each well and wash five
times using at least 300 µL of wash buffer per well. Empty
the wells and strike the plate firmly onto blotting paper. Plot the percent bound (vertical axis) versus the concentration
of melatonin in pg/mL (horizontal axis) using a lin/log graph
8. Add 100 µL of enzyme label (yellow solution) to all wells. paper. Draw the best fitting curve or calculate the standard
9. Cover the plate with a new plate sealer, place the plate curve using a four-parameter logistic (4-PL) algorithm.
on a plate orbital shaker set at 600 rpm and incubate for
Samples and controls
60 minutes (±5 minutes) at 18-28 °C.
• Record the absorbance at 450 nm for each sample, each
10. Remove and discard the plate sealer. Aspirate or invert the
control and well. Subtract the average of the blank wells
plate to empty the solution from each well and wash five
and record the absorbance (=corrected average
times using at least 300 µL of wash buffer per well. Empty
absorbance). Calculate, as described above, the binding
the wells and strike the plate firmly onto blotting paper.
of each pair of sample wells as a percent of incubation
Important: allow the TMB substrate to equilibrate to 18- buffer (B0), with the blank-corrected absorbance of
28°C prior to use. incubation buffer taken as 100%.
11. Add 100 µL of TMB substrate to all wells. • Locate the B/B0 value of the samples on the vertical axis,
12. Cover the plate, place it on a plate orbital shaker set at 600 draw a horizontal line intersecting the standard curve and
rpm, protect the plate from direct light and incubate for read the melatonin concentration (pg/mL) from the
30±5 minutes at 18-28°C. horizontal axis.
13. Add 100 µL of stop solution to all wells. Remove air See table 3 and figure 1 for examples of results and standard
bubbles by pricking them with a pipette tip. Proceed to curves. These results and standard curves are for
step 14 within 30 minutes.
Release date: 2021-05-07 4/28 Direct Saliva Melatonin ELISAdemonstration purposes only. A standard curve must be METHOD COMPARISON
generated for each set of samples to be assayed.
The comparison was done with 78 saliva samples from 10
different donors collected at different daytimes. The
LIMITATIONS samples were analyzed using the presented EK-DSM assay
Melatonin results should be interpreted in conjunction with as well as the Direct Saliva Melatonin Radioimmunoassay
information available from clinical assessment of the patient (RK-DSM) from NovoLytiX. The subsequent linear
and other diagnostic procedures. regression analysis resulted in a correlation factor of R 2 =
0.84, an intercept of 0.77 pg/mL and a slope of 1.21. The
correlation is presented in figure 3.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Intra-Assay Precision: 12.6 %. The intra-assay precision
was calculated from the results of four different saliva
samples within the standard range, measured 10 times in
duplicate in a single run. The results are presented in
table 4.
Inter-Assay Precision: 22.9 %. The inter-assay precision
was calculated from the results of 17 independent runs with 5
samples within the standard range. The results are presented
in table 5.
Detection Limit (LoB): 0.5 pg/mL. 32 wells of incubation
buffer (zero calibrator) were assayed in two independent
runs. The minimum detectable concentration in 0.1 mL of
incubation buffer was calculated by subtracting two standard
deviations of averaged refer values from the OD of zero
calibrator and intersecting the value with the standard curve
obtained in the same run.
Detection Limit (Limit of Quantification - LoQ): 1.6 – 20.5
pg/mL. The limit of quantification of this assay is the
melatonin concentration in saliva that can be measured with
an inter-assay coefficient of variation (CV) of less than 30 %.
The LoQ was determined from 7 different samples from
1.3 – 47.3 pg/mL each sample measured 17 times in
duplicate in independent runs.
Dilution Linearity/Parallelism: 92.2 %. Three saliva
samples with high amount of melatonin were sequentially
diluted with incubation buffer and assayed according to the
assay procedure. The results are presented in table 6.
Due to the complex matrix of saliva samples dilution with
incubation buffer higher than 1:8 will cause a decreased
linearity. Therefore sample dilution with incubation buffer
higher than 1:4 is not recommended.
Spiking Recovery: 97.9%. Two saliva samples from the
same donor, one collected during daytime and one during
night time were titrated against each other and assayed
according the assay procedure twice, independently. The
results are presented in table 7.
Due to the complex and individual nature of the saliva matrix
direct spiking of saliva with melatonin can lead to decreased
recovery rates.
Specificity: The 50% binding (cross-reactivity) of the
melatonin antiserum with different compounds were tested
in the Direct Saliva Melatonin Radioimmunoassay
(RK-DSM) from NovoLytiX and are presented in
table 8.
Release date: 2021-05-07 5/28 Direct Saliva Melatonin ELISADEUTSCH
Reagenz Inhalt Art-Nr. Rekonstitution
ANWENDUNGSZWECK Biotin-Konjugat
1 Flasche
B-EKDSM-BC Gebrauchsfertig
5.5 mL
Der NovoLytiX Direct Saliva Melatonin ELISA (EK-DSM)
Enzym-Marker 1 Flasche
wird gebraucht für die direkte quantitative Bestimmung von B-EKDSM-EL Gebrauchsfertig
Streptavidin-HRP
Melatonin in humanen Speichelproben (Saliva) (1-4). Konjugat 11 mL
TMB-Substrat 1 Flasche
B-TMB Gebrauchsfertig
PRINZIP DER METHODE Mit Citrat gepuffert 11 mL
Der NovoLytiX Direct Saliva Melatonin ELISA ist ein Stopp-Lösung 1 Flasche Gebrauchsfertig
0.25 M Schwefelsäure B-STS
kompetitiver Immunoassay, welcher die Fangantikörper 11 mL korrosiv
(H2SO4)
Technik verwendet. Die im Kit enthaltene Mikrotiterplatte
Tabelle 1
wurde mit dem polyklonalen Kennaway G280 Anti-Melatonin 1)
Das Nullwert-Reagenz enthält eine gesätigte Melatonin Lösung. Kontamin-
Antikörper (5,6) beschichtet. Nach der ersten 16-20 Stunden ationen von anderen Kitkomponenten müssen vermieden werden.
2)
Inkubation mit den vorbehandelten Speichelproben und Die Kalibratoren A, B, C, D und E enthalten die folgenden Melatonin
Kontrollen, sowie den gebrauchsfertigen Kalibratoren, Konzentrationen: 0.48, 1.2, 3.2, 8.0 und 20 pg/ml. Unter Einbezug einer
Probenverdünnung von 20% bei der Vorbehandlung, resultiert für den Test
konkurriert Melatonin während einer 3 Stunden Inkubation jedoch eine Konzentration von: 0.6, 1.5, 4.0, 10, und 25 pg/ml Melatonin.
mit biotinyliertem Melatonin für die Bindungsstellen des 3)
Lot spezifische Melatonin Konzentrationen. Siehe beigelegtes QC
hochspezifischen Antikörpers. Nach einem Waschschritt Datenblatt.
wird der Enzymmarker Streptavidin-konjugierte Meerrettich-
peroxidase (HRP) zugegeben und bindet während einer 60 LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN
Minuten Inkubation an den auf die Oberfläche gebundenen Verschlossene/ Ungeöffnete Reagenzien
Melatonin-Biotin-Antikörper-Komplex. Ungebundener
Bei 2-8°C bis zum Verfallsdatum haltbar. Nach Ablauf des
Enzymmarker wird durch einen Waschschritt entfernt und Verfallsdatums nicht mehr verwenden.
TMB Substrat (Tetramethylbenzidin) wird in die Wells
Geöffnete/ Rekonstituierte Reagenzien
gegeben. In einem weiteren Inkubationsschritt wird ein
Ungebrauchte Streifen direkt in den Alu-
Farbprodukt gebildet, welches umgekehrt proportional zur
Mikrotiterplatte Folienbeutel mit dem Desikator zurücklegen und
Melatonin Konzentration ist. Durch die Zugabe der Stopp- gut verschliessen. Bei 2-8°C bis zu 2 Monate
Lösung ändert sich die Färbung von Blau nach Gelb, welche haltbar
danach bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen Vorbehandlungs-
werden kann. Reagenz
Neutralisierungs- Bei 2-8°C bis zum Verfallsdatum haltbar
Lösung
GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG
Inkubations-Puffer
Reagenz Inhalt Art-Nr. Rekonstitution
Wasch-Puffer
1 Flasche (verdünnt) Bei 2-8°C bis zu 6 Monaten haltbar
Vorbehandlungs- Gebrauchsfertig
Lösung B-EKDSM-PRS
5 mL korrosiv Nullwert-Reagenz
Neutralisierungs- 1 Flasche Gebrauchsfertig Kalibratoren Bei 2-8°C bis zu 4 Monaten haltbar.
Lösung B-EKDSM-NS
5 mL reizend Kontrollen
Mikrotiterplatte Biotin-Konjugat
Mit G280 Anti- 12x8 Wells B-EKDSM-MP Vor Gebrauch
Enzymmarker
Melatonin Ak 2x Waschen Bei 2-8°C bis zum Verfallsdatum haltbar
beschichtet TMB Substrat
Abdeckfolien 3 Stück - Gebrauchsfertig Stopp-Lösung
Wasch-Puffer Tabelle 2
1 Flasche Mit 900 mL
Konzentrat (10x) B-EKDSM-WB deionisiertem
100 mL Wasser lösen ERFORDERLICHE NICHT IM LIEFERUMFANG
Konservierungsstoffe
Nullwert-Reagenz 1)
Mit 1 mL
ENTHALTENE MATERIALIEN
1 Flasche
50 µL Konzentrat; nicht B-EKDSM-BR Inkubations- • Präzisionspipetten mit Einwegspitzen für 5 µL, 50 µL,
vorbehandeln Puffer lösen
100 µL und 1000 µL. Mehrkanalpipette oder
Inkubations-Puffer Repetierpipette für 50 µL und 100 µL.
1 Flasche
B-EKDSM-IB Gebrauchsfertig
(Null-Kalibrator) 12 mL • Polystyren oder Polypropylen Einwegröhrchen zur
Melatonin freier Puffer
Verdünnung der Proben.
Kalibratoren 2) Mit je 1 mL
5 Flaschen B-EKDSM-
50 µL Konzentrat; Inkubations- • 1000 mL Zylinder zur Verdünnung des Waschpuffers.
CASET
Puffer lösen
nicht vorbehandeln • Mikrotiter-Platten-Waschgerät oder Spritzflasche für
Kontrolle tief und Waschpuffer.
hoch 3) Mit je 1 mL
2 Flaschen B-EKDSM-
Inkubations- • Saugfähiges Papier.
50 µL Konzentrat; CONSET
Vorbehandlung siehe Puffer lösen • Kühlschrank.
Seite 8
• Mikrotiter-Platten Orbital-Schüttler.
• Mikrotiterplatten-Photometer mit optischem Filter
(450 nm).
Release date: 2021-05-07 6/28 Direct Saliva Melatonin ELISA• NovoLytiX Saliva Collection Devices, B-SLEEP- müssen vermieden werden. Die Einwegspitzen müssen
CHECK16 oder B-SVC50. nach jedem Pipettierschritt gewechselt werden.
• Die Testdurchführung wurde für die Sleep Check
VORSICHTSMASSAHMEN Anwendung optimiert. Dabei werden das Nullwert-
Sicherheitsmassnahmen Reagenz und die Kalibratoren im Doppel gemessen,
während die Kontrollen und die Patientenproben einzeln
• Dieser Test ist nur für den in-vitro-diagnostischen
bestimmt werden. Diese Anwendung ermöglicht es 16
Gebrauch bestimmt und ist von qualifiziertem individuelle Profile à 5 Messpunkte pro Mikrotiterplatte
Fachpersonal unter Einhaltung der Guten Laborpraxis
durchzuführen. Für andere Anwendungen als der Sleep
(GLP) anzuwenden. Check wird empfohlen, die Bestimmungen im Doppel
• Vorbehandlungsreagenz/ Neutralisierungslösung, anzusetzen.
Substrat- und Stopp-Lösung: Das Vorbehandlungs-
Reagenz (B-EKDSM-PRS) enthält Natriumhydroxid
PROBENVERSAND UND LAGERUNG
(NaOH) und die Neutralisierungs-Lösung (B-EKDSM-
NS) enthält Salzsäure (HCl). Die Substratlösung (B- Versand: Die gesammelten Speichelproben müssen
TMB) enthält Tetramethylbenzidin. Die Stopp-Lösung (B- innerhalb von zwei Tagen in das Labor versandt werden. Die
STS) enthält Schwefelsäure. Jeder dieser Reagenzien gesammelten Proben sollen im Kühlschrank bei 2-8°C
reizt die Augen, die Haut und die gelagert werden.
Schleimhautmembranen. Berührung mit den Augen, der Die Proben sollen nicht am Freitag, Samstag oder am Tag
Haut und die Bekleidung vermeiden. Tragen Sie vor einem Feiertag versandt werden.
geeignete Schutzkleidung, Laborhandschuhe und Lagerung: Die Watterolle mit der absorbierten
Schutzbrille. Nach Berührung sofort mit viel Wasser Speichelprobe kann bis zu 7 Tage bei 2-8 °C im
spülen. Speichelsammelröhrchen gelagert werden. Falls die Proben
• Ungebrauchte Lösungen sollten gemäss der nicht innerhalb einer Woche getestet werden, müssen die
gesetzlichen Bestimmungen entsorgt werden. Proben tiefgefroren werden. Diese können für mindestens 6
Monate bei ≤-20°C gelagert werden. Wiederholte Auftau-
Technische Vorsichtsmassnahmen /Einfrierzyklen sollten vermieden werden.
Kit Komponenten
PROBENSAMMLUNG
• Lesen Sie die Arbeitsanleitung sorgfältig vor der
Testdurchführung durch. Die Testqualität kann negative Die Speichelproben werden mit Hilfe der NovoLytiX
beeinflusst werden, wenn die Reagenzien nicht korrekt Speichelsammelbestecke gesammelt. Die Sammel-
verdünnt, verändert werden, oder nicht entsprechend bestecke können bis zu 3 mL Speichel absorbieren. Zur
der in dieser Anleitung angegebenen Testdurchführung werden 0.2 mL Speichel benötigt.
Lagerungsbedingungen gelagert werden. • Watterollen, die Zitronensäure enthalten, dürfen nicht
• NEU: Das Nullwert-Reagenz (B-EKDSM-BR), die verwendet werden.
Kalibratoren A bis E (B-EKDSM-CASET) und die
• Der Speichelfluss darf nicht durch Kaugummi kauen oder
Kontrollen (B-EKDSM-CONSET) werden als Konzentrat
dem Verzehr von Zitronen stimuliert werden.
geliefert und ersetzen die lyophilisierte Form. Nach
Zugabe von 1 mL Inkubationspuffer (B-EKDSM-IB) • Die Patienten sollten die Probensammlung an einem
sollten die Fläschchen vorsichtig geschüttelt und einige Abend ohne sportliche Aktivitäten und intensive
Male über den fest verschraubten Deckel gedreht Anstrengungen durchführen.
werden, um eventuell an den Fläschchenwänden und • Probensammlungen während der Nacht sollten bei
Verschlusskappen anhaftende Resttropfen zu gedämpftem Licht (≤100 Lux) durchgeführt werden, um
rekonstituieren. einen Einfluss des Lichts auf das Melatonin Profil
• Aufgrund des Produktionsprozesses kann es auszuschliessen.
Rückstände in den Wells der Mikrotiterplatten haben. Sie • Während der Sammlungsdauer darf keine Nahrung zu
werden mit dem Waschschritt (Schritt 2) entfernt und sich genommen werden. Die letzte Mahlzeit sollte
haben keinen Einfluss auf die Ergebnisse. mindestens 30 Minuten vor Beginn der Sammlung
• Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Verfallsdatums eingenommen werden. Auf Bananen und Schokolade
nicht mehr verwendet werden. sollte während des gesamten Tages der Sammlung
• Mischen Sie nicht Reagenzien verschiedener Kit Lots. verzichtet werden. 15 Minuten vor der nächsten
Probengewinnung ist der Mund mit Wasser zu spülen.
• Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass es zu einer
Kontamination zwischen verschiedenen Reagenzien, • Getränke welche künstliche Farbstoffe, Koffein (Kaffee,
Proben und zwischen den Wells kommt. Schwarz- oder Grüntee, IceTea, Cola) oder Alkohol
enthalten, sollten am Abend der Speichelsammlung
• Mikrotiterstreifen dürfen nicht wiederverwendet werden.
vermieden werden.
• Die Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur
• Der Patient sollte während der Zeit der
äquilibrieren lassen und gut mischen (vortexen).
Probengewinnung darauf verzichten Zähne sowohl mit,
Arbeitsanleitung wie auch ohne, Zahnpaste zu putzen. Patienten mit
• Das Nullwert-Reagenz enthält eine gesättigte Melatonin Gingivitis könnten dadurch ihren Saliva mit Plasma oder
Lösung. Kontaminationen von anderen Kit Komponenten sogar Vollblut kontaminieren, was zu unbekannten
Veränderungen führen könnte.
Release date: 2021-05-07 7/28 Direct Saliva Melatonin ELISA• Wenn möglich sollte am Tag der Sammlung kein Aspirin 7. Folie entfernen. Die Lösung aus jedem Well absaugen
oder Medikamente welche Ibuprofen enthalten (Brufen ®, oder ausschütten und fünfmal mit ≥ 300 μL Wasch-
Algifor® Dismenol®, Dolocyl®, Ecoprofen®) eingenommen Lösung pro Well waschen. Die Wells entleeren und auf
werden. Falls der Schlaf- oder Schlaf/Wach- Rhythmus saugfähigem Papier gut ausklopfen.
mit Melatonin behandelt wird, sollte diese Behandlung 8. Je 100 µL Enzym-Marker (gelbe Lösung) zu allen Wells
vor der Probensammlung für mindestens eine Woche zugeben
unterbrochen werden. Probenvorbehandlung im Labor 9. Mit einer neuen Abdeckfolie zudecken und für 60
Probengewinnung aus den Saliva Sammelbestecken Minuten (±5 Min) auf einem Orbital-Schüttler (600 rpm)
Die vom Patienten zugesandten Saliva Sammelbestecke bei 18-28°C inkubieren
werden für ungefähr 5 Minuten bei 3000 rpm (~1500x g) 10. Folie entfernen und entsorgen. Die Lösung aus jedem
zentrifugiert. Das Einhängegefäss mit der Watterolle wird Wells absaugen oder ausschütten und fünfmal mit 300
verworfen. Das verbleibende Röhrchen kann bei 2-8°C oder µl Wasch-Lösung pro Well waschen. Die Wells entleeren
-20°C gelagert werden. und auf saugfähigem Papier gut ausklopfen.
Vorbehandlung Speichelproben und Kontrollen Wichtig: TMB-Substrat vor dem Gebrauch auf 18-28° C
• 200 µL der Kontrollen und der Speichelproben in äquilibrieren lassen.
entsprechend markierte Polypropylen-Röhrchen geben. 11. Je 100 µL TMB-Substrat zu allen Wells geben.
• 25 µL Vorbehandlungs-Lösung mit der Mehrkanal- oder 12. Platte zudecken und für 30±5 Minuten auf einem Orbital-
Repetierpipette in jedes Röhrchen geben. Schüttler (600 rpm) bei 18-28°C und vor Licht geschützt
inkubieren.
• Für 5 Sekunden vortexen und die Röhrchen für 10
Minuten bei 18-28°C stehen lassen. 13. Je 100 µL Stopp-Lösung zu allen Wells zugeben.
Luftbläschen mit einer Pipettenspitze entfernen und
• 25 µL Neutralisierungs-Lösung mit der Mehrkanal- oder
innerhalb von 30 Minuten mit Schritt 14 fortfahren.
Repetierpipette in jedes Röhrchen zugeben und für 5
Sekunden vortexen. 14. Die Absorption in einem Mikrotiter-Platten-Photometer
bei 450 nm messen.
• Die vorbehandelten Proben werden für 5 Min bei 10’000
rpm zentrifugiert. Danach wir mit dem ELISA Verfahren QUALITÄTSKONTROLLE
weitergemacht.
Ein vollständiges Verständnis dieser Anleitung ist für den
ARBEITSANLEITUNG erfolgreichen Gebrauch des Produktes notwendig.
Zuverlässige Resultate werden nur durch die Anwendung
1. Mikrotiter-Platte mit ausreichender Anzahl Streifen für von GLP (aktuelle GLP Richtlinien) und die Einhaltung der
Nullwerte (Blank), Kalibratoren, Kontrollen und Proben Anleitung erreicht.
bereitstellen. Die restlichen Streifen direkt im wiederver- Da keine Melatoninkontrollen im Speichel kommerziell
schliessbaren Alu-Folienbeutel einschliessen und erhältlich sind, empfehlen wir Speichel-“Pools” mit unter-
gekühlt lagern. schiedlichen Melatonin Konzentrationen für die interne
2. Die beschichteten Wells zweimal mit ≥ 300 μL Wasch- Qualitätskontrolle zu verwenden. Die Reproduzierbarkeit
Puffer pro Well waschen. Die Wells entleeren und auf der Eichkurvenparameter und der Kontrollwerte sollte
saugfähigem Papier gut ausklopfen. innerhalb des vom Labor etablierten Erwartungsbereiches
3a. Je 100 µL Nullwert-Reagenz (Blank) in die Wells A1 und liegen. Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind Lot-
A2 geben. spezifisch und sind auf dem zusätzlichen QC-Datenblatt
angegeben. Falls die Ergebnisse des Testes nicht innerhalb
3b. Je 100 µL Inkubations-Puffer (Null-Kalibrator) in die der erwarteten Bereiche liegen und wiederholte Messungen
Wells B1 und B2 geben. einen Durchführungsfehler ausschliessen, sind folgende
3c. Je 100 µL Kalibrator A in die Wells C1 und C2 geben. Punkte zu überprüfen: i) Pipettierung, Temperatur- und
Je 100 µL Kalibrator B in die Wells D1 und D2 geben. Zeitmessende Geräte, ii) Photometer Eichung, iii)
Je 100 µL Kalibrator C in die Wells E1 und E2 geben. Verfallsdaten der Reagenzien, iv) Lagerungs-und
Inkubations-Bedingungen, v) die TMB Substratlösung sollte
Je 100 µL Kalibrator D in die Wells F1 und F2 geben. farblos sein, vi) Wasserreinheit.
Je 100 µL Kalibrator E in die Wells G1 und G2 geben.
3d.100 µL vorbehandelte Kontrolle tief in Wells H1 geben.
STANDARDISIERUNG
100 µL vorbehandelte Kontrolle hoch in Wells H2 geben. Direct Saliva Melatonin ELISA ist gegen UV/VIS kalibriert:
Ɛ278 = 6300 M-1cm-1 in Methanol.
3e.100 µL der vorbehandelten Proben (Einzelwert) in die
weiteren Wells geben.
4. Die Platte mit einer Abdeckfolie verschliessen, für 1
Minute auf einen Orbital-Schüttler (600 rpm) stellen und
dann über Nacht für 16-20 Stunden bei 2-8°C inkubieren.
5. Folie entfernen. In jedes Well je 50 µL Biotin-Konjugat
(blaue Lösung) zugeben. Die Platte mit einer Abdeckfolie
verschliessen und für 1 Minute auf einen Orbital-
Schüttler (600 rpm) stellen.
6. Danach für 3 Stunden (±5 Min) bei 2-8°C inkubieren.
Release date: 2021-05-07 8/28 Direct Saliva Melatonin ELISARESULTATE durch Intersektion auf der im gleichen Ansatz erhaltenen
Standardkurve ermittelt.
Standardkurve
Nachweisgrenze (LoQ): 1.6 – 20.5 pg/ml. Der „Limit of
Optische Dichte aller mit Kalibrator oder Nullwert-Reagenz
Quantification“ des Tests ist die Melatoninkonzentration im
(Blank) gefüllten Wells bei 450 nm messen. Zur Ermittlung
Speichel, welche mit einem Variationskoeffizienten (CV)
der „korrigierten Absorptionsmittelwerte“ wird der Mittelwert
gemessen werden kann, welcher unter 30% liegt. Der LOQ
aus den Doppelmessungen berechnet und der Mittelwert
wurde bestimmt mittels 7 unterschiedlichen Speichelproben
des Nullwert-Reagenzes (Blank) subtrahiert. Die Bindung
zwischen 1.3 und 47.3 pg/mL. Die Proben wurden je 17-mal
(B) jedes Kalibratorpaares als Prozentsatz des Inkubations-
im Doppel in unabhängigen Ansätzen gemessen.
Puffers (B0) berechnen, wobei die Blank-korrigierte
Absorption des Inkubations-Puffers als 100% gesetzt wird. Verdünnungslinearität: 92,2 %. Drei Speichelproben mit
hohen Melatonin Konzentrationen wurden nacheinander mit
netto Absorption
Inkubations-Puffer verdünnt und entsprechend der
B/ BO (%) = %Bindung = x 100 Arbeitsanleitung getestet. Die Resultate sind in Tabelle 6
netto Absorption des InkubationsPuffers dargestellt.
Aufgrund der komplexen Matrix von Speichelproben führen
Den Bindungs-Prozentsatz (Vertikalachse) gegen die Verdünnungen mit Inkubations-Puffer grösser als 1:8 zu
Melatonin-Konzentration in pg/mL (Horizontalachse) auf einer verminderten Linearität. Aus diesem Grunde werden
einem semi-logarithmischen (lin/log) Papier auftragen. Die Probenverdünnungen mit Inkubations-Puffer grösser als 1:4
optimale Kurve (best fitting curve) zeichnen oder mit einem nicht empfohlen.
4-Parameter Logistic (4-PL) Algorithmus berechnen. Wiederfindung: 97.9%. Zwei Speichelproben vom gleichen
Proben und Kontrollen Spender, welche während des Tages sowie während der
Nacht abgenommen wurden, wurden zweimal unabhängig
• Optische Dichte der Proben und Kontrollen bei 450 nm gegeneinander austitriert. Die Daten sind in Tabelle 7
messen. Zur Ermittlung der „Netto Absorptions- dargestellt.
mittelwerte“ wird der Mittelwert des Nullwert-Reagenzes Aufgrund der komplexen und individuellen Beschaffenheit
subtrahiert. Wie oben beschrieben, die Bindung jedes der Speichelmatrix kann ein direktes versetzen des
Probenpaares als Prozentsatz des Inkubations-Puffers Speichels mit Melatonin zu einer verminderten
(B0) berechnen, wobei die Blank-korrigierte Absorption Wiederfindung führen.
des Inkubations-Puffers als 100% gesetzt wird.
Spezifität: Die 50% Bindung (Kreuzreaktivität) des
• B/B0 auf der Standardkurve auftragen und die Melatonin-Antiserums mit verschiedenen Molekülen wurden
entsprechende Melatonin-Konzentration in pg/mL aus im Radioimmunassay von NovoLytiX (RK-DSM) ermittelt
der Horizontal-achse ablesen. und sind in Tabelle 8 dargestellt.
Für ein Beispiel von Resultaten und Standardkurve siehe
METHODENVERGLEICH
Tabelle 3 und Abbildung 1. Diese Daten dienen nur der
Illustration und sind nicht dazu bestimmt, die Ergebnisse Der Vergleich wurde mit 78 Speichelproben von 10
eines anderen Testansatzes danach zu berechnen. Eine verschiedenen Spendern durchgeführt, welche zu unter-
Standardkurve muss für jeden Testansatz jeweils neu schiedlichen Tageszeiten gesammelt wurden. Die Proben
ermittelt werden. wurden mit dem hier beschriebenen EK-DSM ELISA sowie
mit dem Direct Saliva Melatonin Radioimmunassay (RK-
LEISTUNGSEINSCHRÄNKUNGEN DSM) von NovoLytiX getestet. Die durchgeführte
Regressionsanalyse ergab einen Korrelationsfaktor von R2
Die Melatoninergebnisse sollten stets in Verbindung mit = 0.84, einen Achsenabschnitt von 0.77 pg/mL und eine
zusätzlichen Informationen aus der Anamnese des Steigung von 1.21. Die Korrelation ist in Abbildung 3
Patienten und weiteren diagnostischen Verfahren bewertet dargestellt.
werden.
LEISTUNGSMERKMALE
Intra-Assay Präzision: 12.6%. Die Intra-Assay Präzision
wurde aus den Resultaten von vier unterschiedlichen
Speichelproben innerhalb des Standardbereichs berechnet.
Die Proben wurden 10-mal im gleichen Ansatz im Doppel
gemessen. Die Resultate sind in Tabelle 4 dargestellt..
Inter-Assay Präzision: 22.9%. Die Inter-Assay Präzision
wurde aus den Resultaten von 17 unabhängigen Durch-
führungen mit 5 Proben, innerhalb des Standardbereichs
berechnet. Die Resultate sind in Tabelle 5 dargestellt. .
Nachweisgrenze (LoB): 0.5 pg/ml . 32 Wells mit
Inkubations-Puffer (Null-Kalibrator) wurden in zwei
unabhängigen Ansätzen getestet. Die minimal
nachweisbare Konzentration in 0.1 mL Inkubations-Puffer
wurde durch die Subtraktion von zwei
Standardabweichungen des gemittelten Null-Kalibrators und
Release date: 2021-05-07 9/28 Direct Saliva Melatonin ELISAFRANCAIS
Réactifs Quantité Code Reconstitution
UTILISATION 1 flacon
Conjugué biotine B-EKDSM-BC Prêt à l’emploi
5.5 mL
La trousse de dosage Mélatonine salivaire directe ELISA Marqueur
(EK-DSM) des Laboratoires NovoLytiX est destinée à la enzymatique 1 flacon
détermination directe et quantitative de la mélatonine dans les B-EKDSM-EL Prêt à l’emploi
Streptavidine- 11 mL
échantillons de salive (1-4). conjugué HRP
Substrat TMB 1 flacon
B-TMB Prêt à l’emploi
PRINCIPE DU TEST tamponné (citrate 11 mL
La trousse NovoLytiX Direct Saliva Melatonin ELISA est un Solution stop
1 flacon Prêt à l’emploi
immuno-essai compétitif utilisant la technique de l’anticorps 0,25 M acide
11 mL
B- STS
Réactif corrosif
de capture. L’anticorps polyclonal de Kennaway G280 anti- sulfurique (H2SO4)
mélatonine (5, 6) est coaté au fond des puits de la Tableau 1
1)
microplaque fournie dans la trousse. Après 16-20 heures de Le réactif blanc contient une solution saturée de mélatonine. Eviter toute
contamination des autres réactifs de la trousse.
pré incubation, la mélatonine présente dans la salive 2)
Les calibrateurs A, B, C, D et E contiennent respectivement 0.48, 1.2, 3.2,
prétraitée, les contrôles et les calibrateurs, entre en 8.0 et 20 pg/ml de mélatonine tenant compte de la dilution de 20% due
compétition avec la mélatonine marquée à la biotine durant au prétraitement et sont étiquetés, de ce fait, de la façon suivante: 0.6,
1.5, 4.0, 10 et 25 pg/ml de mélatonine, respectivement.
une seconde période d’incubation de 3 heures pour se fixer 3)
Les contrôles présentent des concentrations de mélatonine spécifiques à
sur les sites de son anticorps spécifique. Après un lavage, chaque lot. Veuillez vous reporter aux données additionnelles de QC pour
le marqueur enzymatique, la strepavidine conjuguée à la les valeurs exactes.
peroxydase de raifort (HRP) est ajouté durant une troisième
étape d’incubation de 60 minutes où il se lie aux complexes STOCKAGE ET PEREMPTION DES REACTIFS
mélatonine-biotine-anticorps capturés au fond des puits. Le Réactifs Fermés/ Non Entamés
marqueur enzymatique non lié est éliminé par une étape de
Conserver les réactifs à 2-8°C jusqu’à la date de péremption. Ne pas
lavage, puis le substrat TMB (tetramethylbenzidine) est les utiliser au-delà de la date de péremption.
ajouté aux puits. Au cours d’une prochaine étape
Réactifs Ouverts / Reconstitués
d’incubation, un produit coloré est formé en quantité
inversement proportionnelle à la concentration en Remettre immédiatement les barrettes non
utilisées dans le sachet en aluminium contenant
mélatonine présente dans l’échantillon. La couleur passe du Microplaque les dessiccateurs. Refermer le sachet au moyen
bleu au jaune après addition de la solution stop acide et son du zip et la placer au réfrigérateur. Elle se
intensité peut être mesurée à 450 nm. conserve durant 2 mois à 2-8°C.
Réactif de pré-
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION traitement
Solution de Conserver à 2-8°C jusqu’à la date de péremption
Réactifs Quantité Code Reconstitution neutralisation imprimée sur l’étiquette des flacons.
Solution de pré- 1 flacon Prêt à l’emploi Tampon
B-EKDSM-PRS
traitement 5 mL Réactif corrosif d’incubation
1 flacon Tampon de lavage
Solution de Prêt à l’emploi Stable à 2-8°C jusqu’à 6 mois.
B-EKDSM-NS dilué
neutralisation 5 mL Réactif irritant
Réactif « blanc »
Microplaque
Laver 2x avant Calibrateurs Stables à 2 -8°C jusqu’à 4 mois.
Precoatée avec 12x8 puits B-EKDSM-MP
l’anticorps G280 anti- utilisation Contrôles
mélatonine Conjugué Biotine
Film adhésif 3 pièces - Prêt à l’emplo Marqueur
Tampon de lavage enzymatique Conserver à 2-8°C jusqu’à la date de péremption
Diluer avec
concentré (10x)
1 flacon imprimée sur l’étiquette des flacons.
B-EKDSM-WB 900 mL d’eau Substrat de TMB
100 mL déionisée
avec conservateurs
Solution stop
Réactif « blanc »1) Reconstituer avec
1 flacon Tableau 2
50 µL de concentré ; B-EKDSM-BR 1 mL de tampon
ne pas prétraiter d’incubation
Tampon MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
d’incubation
1 flacon • Pipettes de précision réglables avec pointes jetables
B-EKDSM-IB Prêt à l’emploi
(Calibrateur zéro)
12 mL pour 5 μL, 50 μL, 100 μL et 1000 μL. Pipettes
Tampon exempt de
mélatonine
automatiques ou pipettes multi pointe de 50 μL et
100 μL.
Calibrateurs2) Reconstituer avec
5 flacons
50 µL de concentré ;
B-EKDSM-
1 mL de tampon • Tubes jetables en polypropylène ou polystyrène pour la
CASET
ne pas prétraiter d’incubation préparation des dilutions d’échantillons.
Contrôles élevé et • Eprouvette graduée de 1000 mL pour la préparation du
bas3) Reconstituer avec tampon de lavage.
2 flacons B-EKDSM-
50 µL de concentré ; 1 mL de tampon
CONSET
d’incubation • Laveur automatique de microplaques ou pissette pour le
pour le prétraitement
voir page 12 tampon de lavage.
Release date: 2021-05-07 10/28 Direct Saliva Melatonin ELISA• Papier absorbant. • Laisser les réactifs équilibrer à la température ambiante.
• Réfrigérateur. Bien mélanger (au vortex) les réactifs avant utilisation.
• Agitateur de microplaques. Procédure
• Lecteur de microplaques pour la mesure de l’absorbance • Le réactif « blanc » contient une solution de mélatonine
à 450 nm. saturée. Eviter toute contamination des autres réactifs
• NovoLytiX Saliva Collection Devices, B-SLEEP- contenus dans le kit. Changer d’embout entre chaque
CHECK16 ou B-SVC50. étape de pipetage.
• La procédure de dosage a été optimisée pour le Sleep
PRECAUTIONS Check. La détermination se fait en double pour le réactif
« blanc » et les calibrateurs et en simple pour les
Précautions de sécurité
contrôles et les patients. Une microplaque permet ainsi
• Ce test est prévu pour une utilisation in vitro et doit être le test de 16 profils individuels à 5 points. Pour les
réalisé par un personnel qualifié, en accord avec les applications autres que celles relative au Sleep Check
bonnes pratiques de laboratoire (BPL). des déterminations en double sont recommandées.
• Prétraitement/solution de neutralisation, substrat et
solution stop: La solution de prétraitement (B-EKDSM- ENVOI ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS
PRS) contient de l’hydroxyde de sodium (NaOH) et la
solution de neutralisation (B-EKDSM-NS) contient de Envoi: Les échantillons de salive doivent être envoyés au
l’acide chlorhydrique (HCl). Le Substrat de TMB (B-TMB) laboratoire dans les deux jours. Les tubes de prélèvement de
contient du tétraméthylbenzidine (TMB). La solution stop salive employés doivent être gardés au réfrigérateur à 2-8 °C.
(B-STS) contient de l’acide sulfurique (0,25 M). Ces Les échantillons doivent pas être envoyés les vendredis,
substances irritent les yeux, la peau ainsi que les samedis ou avant les jours fériés.
muqueuses. Eviter par conséquent tout contact avec les
Stockage : Les échantillons de salive absorbés sur les
yeux, la peau et les habits. Porter des vêtements, de
tampons de coton peuvent être stockés dans le dispositif de
gants et des lunettes de protection appropriés. En cas de
prélèvement jusqu’à 7 jours à 2-8 °C. Si l’on ne procède pas
contact avec les yeux ou la peau, laver immédiatement
à l’essai dans la semaine, les échantillons doivent être
et abondamment à l’eau.
congelés et peuvent ainsi être stockés au moins 6 mois à
• Pour en savoir plus sur les précautions pour la ≤-20 °C. Des cycles répétés de congélation – décongélation
manipulation et l’élimination des réactifs du kit, nous vous doivent être évités.
recommandons fortement de consulter l’organisme
réglementaire compétent pour votre pays.
PRELEVEMENT D‘ECHANTILLONS
Précautions techniques
Prélever la salive en utilisant le set de prélèvement de salive
Composants du Kit NovoLytiX. Le dispositif peut absorber jusqu’à 3 mL de
salive. Le mode opératoire préconise une quantité 0.2 mL
• Lire attentivement les instructions avant de réaliser le
de salive.
test. Le test ne donnera pas les résultats escomptés en
cas de dilution incorrecte ou de modification des réactifs, • N’employez pas les tampons de coton contenant l’acide
ou de stockage dans des conditions autres que celles citrique.
détaillées dans le présent mode d’emploi. • Ne stimulez pas des sécrétion de salive en machant du
• NOUVEAU : Le Réactif « blanc » (B-EKDSM-BR), les chewing-gum ou en mangeant du citron.
calibrateurs A à E (B-EKDSM-CASET) et les contrôles • Les patients doivent effectuer la collecte le soir sans
(B-EKDSM-CONSET) sont fournis sous forme activités sportives ni efforts intenses.
concentrée et remplacent la forme lyophilisée. Après
• Lors de prélèvements nocturnes, il convient d’utiliser des
avoir ajouté 1 ml de tampon d'incubation (B-EKDSM-IB),
lumières tamisées (lumière jaune de ≤100 lux ou lampe
les flacons doivent être doucement secoués et retournés
de poche) afin d’éviter d’influencer le profil.
plusieurs fois sur le bouchon bien vissé afin de
reconstituer les gouttes éventuellement restées • Aucun aliment ne sera pris durant le temps de
attachées aux parois du flacon et au bouchon. prélèvement. Le dernier repas doit être pris au moins 30
minutes avant le début du prélèvement. Des bananes et
• Les puits de la microplaque peuvent être recouverts de
du chocolat ne doivent pas être consommés le jour du
résidus formés lors du processus de production. Ils sont
prélèvement. Rincer la bouche avec de l'eau 15 minutes
éliminés par le lavage (voir l'étape 2 de la procédure) et
avant la collecte.
n'ont aucune influence sur les résultats.
• Les boissons contenant des colorants artificiels, de la
• Les composants ne doivent pas être utilisés au-delà de
caféine (café, thé noir ou vert, thé glacé, cola) ou alcool
la date d'expiration imprimée sur les étiquettes.
sont à éviter le soir de prélèvement.
• Ne pas mélanger des réactifs de lots différents.
• De la même façon, le brossage des dents avec ou sans
• Il convient de prendre toutes les précautions requises dentifrice est déconseillé durant la période de
pour empêcher toute contamination croisée entre prélèvements. Les résultats de patients présentant une
réactifs, entre échantillons ou entre puits. gingivite risquent également d’être erronés en raison de
• Les micropuits sont à usage unique. la présence de sang complet ou de plasma dans les
prélèvements.
Release date: 2021-05-07 11/28 Direct Saliva Melatonin ELISA• Aspirine ou médicaments contenant de l’Ibuprofène 3e. Pipeter 100 µL d’échantillons prétraité (en simple) dans
(Brufen®, Algifor® Dismenol®, Dolocyl®, Ecoprofen®) les puits suivants.
doivent être évités le jour du prélèvement. Si votre 4. Couvrir la plaque avec un couvercle opaque, la placer sur
sommeil ou votre rythme circadien est traité par la un agitateur de plaque pendant 1 minute à 600 rmp et
mélatonine, celle-ci doit être arrêtée au moins une puis incuber 16-20 heures à 2-8°C.
semaine avant le prélèvement.
5. Enlever et jeter l’adhésif. Ajouter 50 µL de conjugué
biotine (solution bleue) à tous les puits. Recouvrir la
PRETRAITEMENT DE L’ECHANTILLON plaque avec un adhésif puis la placer sur un agitateur de
(LABORATOIRE) plaque pendant 1 minute à 600 rmp.
6. Incuber pendant 3 heures (± 5 minutes) à 2-8°C.
Récupération de l’échantillon à partir du set de
7. Enlever et jeter l’adhésif. Vider les puits et laver 5 fois avec
prélèvement de salive
au moins 300 µL de tampon de lavage/ puits. Vider les
Centrifuger les tubes de prélèvement de salive envoyés par puits et taper fermement la microplaque sur du papier
le patient pendant environ 5 min à 3000 rpm (~1500x g). absorbant.
Jeter l’insert avec le tampon et stocker le tube à 2-8° C ou à
-20° C. 8. Ajouter 100 µL de marqueur enzymatique (solution
jaune) à tous les puits.
Prétraitement des échantillons de salive et contrôles
9. Couvrir la microplaque avec un adhésif et incuber durant
• Pipeter 200 µL d’échantillon de salive ou de contrôle 60 minutes ( 5 min) à 18-28°C, sur un agitateur à
dans des tubes propres en polypropylène. microplaques à 600 rmp.
• Ajouter 25 µL de solution de prétraitement à chaque 10. Enlever et jeter l’adhésif. Vider les puits et laver 5 fois
tube en utilisant une multi pipette ou une pipette avec au moins 300 µL de tampon de lavage/ puits. Vider
automatique. les puits et taper fermement la microplaque sur du papier
• Vortexer pendant 5 secondes et les laisser reposer absorbant.
pendant 10 minutes à 18-28 °C. Important: veiller à ce que la solution substrat soit à
• Ajouter 25 µL de solution de neutralisation en utilisant température ambiante (18-28°C) avant son utilisation à
une multi pipette ou une pipette automatique. Vortexer l’étape 11.
pendant 5 secondes. 11. Ajouter 100 µL de substrat TMB dans chaque puits.
• Centrifuger les échantillons prétraités pendant 5 min à 12. Couvrir la microplaque avec un adhésif et la placer sur
10’000 rpm. Procéder à la détermination par ELISA. un agitateur programmé à 600 rmp, en veillant à ce
qu’elle soit protégée de la lumière directe et durant 30
PROCEDURE minutes (± 5 min) à 18-28°C
13. Ajouter 100 µL de solution stop à tous les puits. Enlever
1. Préparer une microplaque avec suffisamment de barrettes
toutes les bulles d’air au moyen d’une pointe de pipette.
pour pouvoir analyser tous les calibrateurs, contrôles et
Passer à l’étape 14 dans les 30 minutes
échantillons prévus. Remettre sans attendre l’excédent
de barrettes dans le sachet en aluminium prévue à cet 14. Mesurer l’absorbance à 450 nm au moyen d’un lecteur
effet et contenant les dessiccateurs. Conserver au de microplaque.
réfrigérateur.
2. Laver les puits coatés à deux reprises avec au moins CONTROLE DE QUALITE
300 μL de tampon de lavage/ puits. Vider les puits et Une compréhension approfondie de ce manuel est
taper la microplaque fermement sur du papier absorbant. nécessaire à l’utilisation correcte de ce produit. Des résultats
3a.Pipeter 100 µL de réactif « blanc » en double dans les fiables ne seront obtenus que par un travail en laboratoire
puits A1 et A2. précis (bonnes pratiques de laboratoire usuelles) et en
3b. Pipeter 100 µL de tampon d’incubation (calibrateur zéro/ suivant fidèlement les recommandations de cette brochure.
référence) en double dans les puits B1 et B2. Comme il n’existe pas de contrôles salivaires de mélatonine
3c. Pipeter 100 µL de calibrateur A en double dans les puits commercialement disponibles, nous recommandons
C1 et C2. d’utiliser des pools salivaires présentant différents taux de
Pipeter 100 µL de calibrateur B en double dans les puits mélatonine. Tous les contrôles doivent avoir une valeur
D1 et D2. comprise entre les limites de confiance établies. Les limites
de confiance des contrôles sont spécifiques à chaque lot et
Distribuer 100 µL de calibrateur C en double dans les
sont indiquées sur la feuille de QC contenue dans chaque
puits E1 et E2.
trousse.
Distribuer 100 µL de calibrateur D en double dans les La reproductibilité des paramètres de la courbe
puits F1 et F2. d’étalonnage ainsi que des valeurs des contrôles devrait être
Distribuer 100 µL de calibrateur E en double dans les comprise dans le domaine des valeurs attendues établies
puits G1 et G2 par chaque laboratoire.
3d. Pipeter 100 µL du contrôle faible prétraité dans le puit Si la performance des mesures ne correspond pas aux
H1. limites établies et que les répétitions excluent toute erreur
technique, il est recommandé de contrôler les paramètres
Pipeter 100 µL de contrôle elevé prétraité dans le puit
suivants: i) pipetage, appareils de mesure de température et
H2.
de temps, ii) calibrage des instruments, iii) date de
péremption des réactifs, iv) conditions de stockage et
Release date: 2021-05-07 12/28 Direct Saliva Melatonin ELISAYou can also read
