Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Governing Hair Follicle Stem Cell Function

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Intrinsic and Extrinsic Mechanisms
Governing Hair Follicle Stem Cell
Function

 Doctoral Thesis

 Author(s):
 Gonzalez Celeiro, Meryem

 Publication date:
 2019

 Permanent link:
 https://doi.org/10.3929/ethz-b-000339160

 Rights / license:
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DISS. ETH NO. 25599

   Intrinsic and Extrinsic Mechanisms
Governing Hair Follicle Stem Cell Function

          A thesis submitted to attain the degree of
          DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
                     (Dr. sc. ETH Zurich)

                        presented by
             MERYEM GONZÁLEZ CELEIRO
                      Lda. in Pharmacy
                   University of Barcelona
                   born March 28th, 1987
                       citizen of Spain

                  examination committee:
               Prof. Markus Stoffel, examiner
              Prof. Ya-Chieh Hsu, co-examiner
           Prof. Constance Ciaudo, co-examiner
             Prof. Sabine Werner, co-examiner

                            2019

Abstract

Somatic stem cells are required for tissue homeostasis and repair, and their
dysfunction is linked to a wide variety of diseases including degenerative diseases,
chronic wounds, and cancer. Understanding the mechanisms that regulate their
behavior would allow the manipulation of these cells in a targeted manner to achieve
therapeutic benefit. In this thesis we use hair follicle stem cells (HFSCs), a
population that drives hair regeneration as well supports tissue repair, as a paradigm
to study the mechanisms that regulate somatic stem cells. Stem cell regulation can
be determined by intrinsic factors, such as the gene sets that they express, as well
as by extrinsic factors that are provided by niche and can modulate a stem cell’s
gene expression program.

To gain insight into novel intrinsic regulators of stem cell behavior we have focused
on the lncRNA Crnde utilizing a previously generated mouse model. Long noncoding
RNAs (lncRNAs) have been recently recognized as functional molecules.
Characterization of the spatiotemporal expression pattern of Crnde shows that this
lncRNA is expressed in specific cell types during development and in adulthood.
Although deletion of Crnde causes changes in global gene expression during
development, these knockout mice develop without overt abnormalities. In HFSCs,
Crnde exhibited a dynamic expression: it was higher in quiescent rather than in an
active (proliferative) state. Moreover, we identified Shh, a critical factor that promotes
hair regeneration, as a negative regulator of Crnde. Taken together, these results
suggest Crnde may promote stem cell quiescence. Nevertheless, analysis of the hair
cycle pattern, stem cell activation dynamics, maintenance of the stem cell pool, long-
term self renewal capacity, wound healing and in vitro proliferation capacity of Crnde
knockout mice, though suggestive, resulted in no or inconsistent phenotypes.

Next, to study how the behavior of somatic stem cells is influenced by their niche, we
surveyed cells surrounding the HFSCs. We identified the sympathetic nerves as a
plausible component of the HFSC niche. Through a combination of chemical
ablation, serial block-face scanning electron microscopy, and cell-type specific gene
knockout we determined that the sympathetic nerves form a neuroeffector junction

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with HFSCs and regulate their activation directly through secretion of norepinephrine
that binds to the β2-adrenergic receptor located on the HFSCs. Furthermore,
sympathetic nerves are closely associated with the arrector pili muscle, and while the
nerves are the functional unit of the niche, the arrector pili muscle is crucial for
maintaining the sympathetic innervation in the skin. Lastly, we show that SHH
secreted from the hair follicle is required for the formation of the arrector pili muslce
and hence sympathetic innervation

Taken together, this work aimed to identify new mechanisms that regulate HFSC
behavior. While further work needs to be done to determine the role of Crnde in
HFSC, we have identified the sympathetic nerves as a new niche component that
regulates HFSCs directly, thereby narrowing the gap in knowledge that would allow
the use of stem cells for therapeutic interventions.

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Sommario

Le cellule staminali somatiche (o adulte) sono essenziali per mantenere l’omeostasi
dei tessuti, e il loro malfunzionamento è implicato in una vasta gamma di patologie
che includono le malattie degenerative, le ferite croniche e il cancro. Conoscere in
dettaglio i meccanismi che regolano il comportamento delle cellule staminali
somatiche ne permetterebbe la manipolazione mirata a ottenere benefici terapeutici.
In questa tesi abbiamo usato le cellule staminali somatiche dei follicoli piliferi (hair
follicle stem cells, HFSCs), una popolazione cellulare che promuove la rigenerazione
dei peli e la riparazione dei tessuti, come paradigma per studiare i meccanismi che
regolano le cellule staminali somatiche. La regolazione delle cellule staminali è
determinata sia da fattori intrinseci, come l’identità dei geni che essi esprimono, e da
da fattori estrinseci presenti nella nicchia ambientale, che possono ulteriormente
modulare il programma di espressione genica.

Con lo scopo di identificare nuovi regolatori intrinseci del comportamento delle
cellule staminali, in questo studio ho usato un sistema basato sul “Long noncoding
RNAs” (lncRNAs) Crnde in un modello di topo transgenico generato in precedenza. I
lncRNAs sono stati recentemente riconosciuti come importanti molecole che
modulano      funzionalità    cellulari.   La     caratterizzazione     spazio-temporale
dell’espressione genica di Crnde ha evidenziato come esso sia espresso in
particolari tipi di cellule durante lo sviluppo e l’età adulta del topo. Sebbene il
knockout genetico di Crnde abbia causato cambiamenti globali nell’espressione
genica durante lo sviluppo, i topi con questa modificazione genetica si sono
sviluppati senza anomalie. Nelle HFSCs, Crnde ha un espressione genica dinamica:
elevata in situazione di quiescenza ma non nello stato di attiva proliferazione
cellulare. In aggiunta, ho identificato SHH, un fattore critico che promuove le
rigenerazione dei peli, come regolatore negativo di Crnde. In sintesi, questi risultati
suggeriscono che Crnde potrebbe promuovere la quiescenza delle cellule staminali.
Nonostante queste osservazioni, l’analisi del ciclo di sviluppo dei peli, dell’attivazione
temporale delle cellule, dell’omoestasi delle cellule staminali, della capacità
rigenerativa di lungo termine, della cicatrizzazione delle ferite e della proliferazione in

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vitro nei topi con knockout di Crnde hanno indicato la mancanza di altri fenotipi o
mostrato fenotipi inconsistenti.

Per comprendere come il comportamento delle cellule staminali sia influenzato dalla
loro nicchia ambientale, ho successivamente studiato le cellule che circondano le
HFSCs e identificato i nervi simpatici come probabili componenti della nicchia.
Attraverso una combinazione di ablazione chimica, microscopia elettronica e
knockout genici, ho determinato che i nervi simpatici formano delle giunzioni
neuroeffettrici con le HFSCs e ne regolano l’attivazione attraverso secrezione di
norepinefrina che si lega al recettore adrenergico β2 localizzato nelle HFSCs. In
aggiunta, i nervi simpatici sono risultati strettamente collegati al muscolo erettore del
pelo. Sebbene i nervi siano risultati essere l’unità funzionale della nicchia, il muscolo
erettore   del   pelo   è   risultato   essere   fondamentale   per     il   mantenimento
dell’innervazione simpatica della pelle. In sintesi, ho mostrato che SHH secreto dal
follicolo pilifero è necessario per la formazione del muscolo erettore del pelo e, di
conseguenza, per l’ innervazione simpatica della pelle.

In conclusione, in questa tesi ho identificato nuovi meccanismi che regolano il
comportamento delle cellule staminali somatiche dei follicoli piliferi. Sebbene ulteriori
studi siano necessari per determinare il preciso ruolo di Crnde, in questo lavoro ho
identificato i nervi simpatici come una nuova componente della nicchia che regola
direttamente le cellule staminali somatiche dei follicoli piliferi, eliminando così una
barriera all’uso delle cellule staminali come intervento terapeutico.

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