Implications of anabolic androgenic steroid use and the mechanism(s) of muscle memory for an anti-doping approach.
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DOTORAL PROGRAM IN
HUMAN MOVEMENT AND SPORT SCIENCES
XXXIII Cycle
2017/2020
Title of the Thesis:
Implications of anabolic androgenic steroid use
and the mechanism(s) of muscle memory for an
anti-doping approach.
Scientific area: BIO/09
PhD Candidate Tutor
Giscard Humberto Oliveira Lima Prof. Paolo BorrioneABSTRACT Background. Anabolic androgenic steroids (AAS) are the most widespread of all prohibited substances used in sport. The administration of AAS improves performance as they activate important pathways involved in development, growth, and differentiation of muscle cells. The effects of AAS use on muscle hypertrophy has been associated with a phenomenon called “muscle memory”, the premise of this hypothesis is that myonuclei acquired by exercise and/or testosterone administration during hypertrophy are not lost after a period of detraining and atrophy. The long-term effect of muscle memory has important implications for anti- doping. For example, a better understanding of the muscle memory mechanism may directly influence the length of anti-doping suspensions. Purpose. The aim of this research was to study the putative “muscle memory phenomenon”, its occurrence and mechanism, based on both human and animal studies with particular focus, in the first instance, on morphological changes of skeletal muscle acquired during AAS exposure. Methods (Human Study). Fifty-six participants consented to take part in the study and visited the laboratory for a skeletal muscle biopsy within the following groups: sedentary controls (C=7), resistance trained (RT=23) lifters, RT-current AAS users (RT-AS=19) and previous AAS users (PREV=7). RT-AS were biopsied on a second occasion once AAS usage had ceased for ≥18 weeks. Immunohistochemistry data between groups were compared. Results (Human Study). Mean fibre Cross Sectional Area (CSA) was significantly higher in RT-AS compared to C. There were no significant differences between C, RT, RT-AS and PREV for myonuclei per fibre. Participants whose number of weeks of AAS exposure was ≥53 weeks presented the highest CSA and myonuclei per fibre both of which were significantly higher than 20-52 weeks of exposure and for ≥53 weeks CSA was significantly greater than C and RT. Five returning participants (RP1-5) visited twice, Fat Free Mass (FFM) of four, who ceased AAS usage ≤2 weeks prior to visit one with 19-28 weeks between visits, decreased by 3.9 - 4.7kg. Fibre CSA decreased for RP1 and RP2 between visits whilst myonuclei per fibre
remained similar. Fibre CSA and myonuclei per fibre increased for RP3 between visits. Methods (Animal Study). This complementary to the Human study aimed to standardise the administration of AAS. Fifty-four C57BL/6 mice at 4 months of age were submitted to surgery for the subcutaneous implantation of either a 1-cm silicone laboratory tubing implant that was empty (Blank) or containing about 10mg of 5α- dihydrotestosterone (DHT) into the neck. In the first stage of the study, 12 male mice (n=6 in each DHT or Blank groups) were submitted to 5 weeks of DHT treatment (5w-DHT), or control (5w-Blank). The second stage used another 12 male mice with the same experimental design, but with 10 weeks of treatment (i.e., groups 10w- DHT and 10w-Blank) to investigate the impact of length of exposure. Additionally, 6 male mice were submitted to castration surgery before 4 weeks of age, they received either DHT (Cast-DHT) or Blank (Cast-Blank) implant (n=3 each) at 3 months age and exposure lasted 5 weeks. Finally, 24 female mice at 3 months age were submitted to surgery for implantation of 1-cm silicone laboratory tubing with DHT or empty (Blank), then divided into 4 groups (n=6) following the same design of the first two stages using male mice (i.e., 5w-DHT, 5w-Blank, 10w-DHT and 10w-Blank). The animals were weighed on the day the implant was inserted and on the day of physiological analysis and muscle collection. After functional and physiological analysis and immediately prior to muscle and organ collection, the animals under anaesthetic were euthanized by cervical dislocation. Results (Animal Study). The animal model study revealed that the treatment with DHT was able to increase total body and muscle mass in both male and female mice. The differences between the groups were more pronounced after 10 weeks of DHT treatment compared with 5 weeks. Furthermore, castrated mice treated throughout 5 weeks showed greater response to treatment than mice that were not castrated. Conclusions. From the data collected to date, we are unable with the present subject numbers to confirm that elevated myonuclei per fibre values in previous AAS users compared to the other groups is a result of myonuclei retention post AAS usage as there are no significant differences between groups. The AAS users
presented large differences in their timelines of AAS usage, by classifying
participants based on their cumulative dose of AAS exposure over their lifetime and
the cumulative number of weeks of AAS exposure it seems that the greater the dose
used and the longer the time of exposure the greater the effect on increases on
muscle fibre CSA and myonuclei per fibre values. However, most of the users
sampled that had the highest dose and/or weeks of AAS exposure were current
users and it cannot be inferred that these elevated myonuclei per fibre values are
from myonuclei retention post AAS usage. More participants (mainly returning ones)
are needed to confirm if myonuclei acquired during the process of muscle
hypertrophy from AAS usage are retained after a period of atrophy. Similarly, the
ongoing animal study demonstrated that female and castrated-male mice have a
higher anabolic response for to DHT treatment than male mice. Our hypothesis is
that some mechanism of negative feedback could decrease the endogenous
production of testosterone. Furthermore, the female mice treated with DHT
presented higher maximum force and recovery than a control group, however a
longer period of treatment (i.e., 10 weeks versus 5 weeks) did not reveal significant
difference in anabolic response of muscle mass, maximum force or fatigue recovery.
The castrated male mice presented higher muscle mass and higher grip strength,
despite lower specific maximum force. The groups treated with subcutaneous DHT
revealed higher heart mass, which demonstrates the side effects of AAS use mainly
in female and castrated mice. Further analyses are needed to investigate if cellular
aspects such as fibre CSA, myonuclei per fibre, satellite cells, and fibre type also
present difference between the groups in our study.
RIASSUNTO
Introduzione. Gli steroidi androgeni anabolizzanti (in inglese anabolic androgenic
steroid - AAS) sono le più diffuse di tutte le sostanze proibite utilizzate nello sport.
La somministrazione di AAS migliora le prestazioni sportive, in quanto attivano
importanti percorsi coinvolti nello sviluppo, nella crescita e nella differenziazione
delle cellule muscolari. Gli effetti dell'uso degli AAS sull'ipertrofia muscolare sono
stati associati a un fenomeno chiamato "memoria muscolare", la premessa di questaipotesi è che i mionuclei acquisiti dall'esercizio e/o dalla somministrazione di testosterone durante l'ipertrofia non si perdono dopo un periodo di sospensione dell’allenamento e atrofia. L'effetto a lungo termine della memoria muscolare ha importanti implicazioni per l'antidoping. Ad esempio, una migliore comprensione del meccanismo della memoria muscolare può influenzare direttamente la durata delle sanzioni antidoping. Obbiettivo. L'obiettivo di questa ricerca è stato quello di studiare il presunto “fenomeno della memoria muscolare”, la sua insorgenza e il suo meccanismo, sulla base di studi sull'uomo e sugli animali con un focus particolare, in primo luogo, sui cambiamenti morfologici del muscolo scheletrico acquisiti durante l'esposizione a AAS. (Studio Umano). Cinquantasei partecipanti hanno acconsentito a partecipare allo studio e sono stati sottoposti ad una biopsia muscolare. I soggetti partecipanti sono stati suddivisi nei seguenti gruppi di studio: controlli sedentari (C = 7), praticanti allenamento di resistenza (in inglese resistance trained - RT) (RT = 23), utilizzatori di AAS e praticanti allenamento di resistenza (RT-AS = 19) e con il pregresso uso di AAS (in inglese previous) (PREV = 7). RT-AS sono stati sottoposti a biopsia in una seconda occasione, poiché l'uso di AAS è cessato per ≥18 settimane (partecipanti che sono tornati, in inglese returning participants - RP). Sono stati confrontati i dati di immunoistochimica tra i gruppi. Risultati (Studio Umano). L'area della sezione trasversale media della fibra (in inglese cross-sectional area - CSA) era significativamente maggiore in RT-AS rispetto a C. Non sono state rilevate differenze significative tra C, RT, RT-AS e PREV per quanto riguarda la composizione dei mionuclei. I partecipanti il cui numero di settimane di esposizione a AAS era ≥53 settimane avevano il CSA e i mionuclei di fibra più alti, entrambi significativamente maggiori di quanto rilevato dopo 20-52 settimane di esposizione e per ≥53 settimane CSA era significativamente maggiore di C e RT. Cinque partecipanti sono stati valutati 2 volte (RP1-5), la massa magra (FFM) di quattro, che hanno smesso di usare AAS ≤2 settimane prima della visita uno con 19-28 settimane tra le visite, è diminuita di 3,9 - 4,7 kg. La CSA della fibra
è scesa a RP1 e RP2 tra le visite, mentre la composizione in mionuclei è rimasta simile. La CSA della fibra e la composizione in mionuclei sono aumentate a RP3 tra le visite. Metodi (Studio su modello Animale). Questo studio, complementare allo studio sull'uomo, mirava a standardizzare la somministrazione di AAS. Cinquantaquattro topi C57BL/6 a 4 mesi di età sono stati sottoposti a intervento chirurgico per l'impianto sottocutaneo di un tubo di silicone vuoto da 1 cm (in inglese Blank) o contenente circa 10 mg di 5α-diidrotestosterone (DHT) nel collo. Nella prima fase dello studio, 12 topi maschi (n = 6 in ciascun gruppo DHT o Blank) sono stati sottoposti a 5 settimane (in inglese weeks) di trattamento con DHT (5w-DHT) o controllo (5w-Blank). La seconda fase ha utilizzato altri 12 topi maschi con lo stesso disegno sperimentale, ma con 10 settimane di trattamento (cioè i gruppi 10w-DHT e 10w-Blank) per studiare l'impatto della durata di esposizione. Inoltre, 6 topi maschi sono stati sottoposti a chirurgia di castrazione prima delle 4 settimane di età, hanno ricevuto impianti DHT (Cast-DHT) o Blank (Cast-Blank) (n = 3 ciascuno) a 3 mesi di età e l'esposizione è durata 5 settimane. Infine, 24 topi di sesso femminile di 3 mesi sono stati sottoposti a intervento chirurgico per l'impianto di tubi da laboratorio in silicone da 1 cm con DHT o vuota (Blank), poi sono stati divisi in 4 gruppi (n = 6) seguendo lo stesso disegno sperimentale precedentemente descritto usando topi maschi (es. 5w-DHT, 5w-Blank, 10w-DHT e 10w-Blank). Gli animali sono stati pesati il giorno del posizionamento dell'impianto e il giorno dell'analisi fisiologica e del prelievo muscolare. Dopo l'analisi funzionale e fisiologica e immediatamente prima della raccolta di muscoli e organi, gli animali in anestesia sono stati sacrificati per lussazione cervicale. Risultati (Studio su modello Animale). Lo studio su modello animale ha rivelato che il trattamento con DHT è stato in grado di aumentare la massa corporea e muscolare totale nei topi maschi e femmine. Le differenze tra i gruppi erano più pronunciate dopo 10 settimane di trattamento con DHT rispetto a 5 settimane. Inoltre, i topi castrati trattati per 5 settimane hanno mostrato una risposta maggiore al trattamento rispetto ai topi non castrati.
Conclusioni. Sulla base dei dati raccolti finora, non siamo in grado, con il numero di soggetti reclutati, di confermare che valori elevati di mionuclei per fibra nei soggetti con una storia di utilizzo di AAS rispetto agli altri gruppi siano il risultato di un effetto diretto degli AAS sui mionuclei dal momento che non sono state evidenziate differenze significative tra i gruppi. Gli utilizzatori di AAS hanno presentato grandi differenze nei loro programmi di utilizzo AAS, classificando i partecipanti in base alla loro dose cumulativa di esposizione all'AAS nel corso della loro vita e il numero cumulativo di settimane di esposizione all'AAS sembra che maggiore è la dose utilizzata e più lungo è il tempo di esposizione, maggiore è l'effetto sugli aumenti dei valori di CSA e dei mionuclei delle fibre muscolari. Tuttavia, la maggior parte dei soggetti reclutati che avevano la dose più alta e/o le settimane di esposizione all'AAS erano attualmente ancora utilizzatori di AAS e non si può dedurre che questi valori elevati di mionuclei per fibra siano legati esclusivamente ad una pregressa assunzione di AAS. Sono necessari più partecipanti (soprattutto quelli di ritorno) per confermare che i mionuclei acquisiti durante il processo di ipertrofia muscolare attraverso l'uso di AAS vengono mantenuti dopo un periodo di atrofia. Allo stesso modo, lo studio in corso sugli animali ha dimostrato che i topi castrati maschi e i topi di sesso femminile hanno una maggiore risposta anabolica al trattamento con DHT rispetto ai topi maschi. La nostra ipotesi è che qualche meccanismo di feedback negativo possa diminuire la produzione di testosterone endogeno. Inoltre, le femmine di topo trattate con DHT hanno mostrato una forza massima maggiore e un recupero migliore rispetto a un gruppo di controllo, tuttavia, un periodo di trattamento più lungo (cioè 10 settimane contro 5 settimane) non ha rivelato una differenza significativa nella risposta anabolica di massa muscolare, forza massima o recupero dalla fatica. I topi maschi castrati hanno mostrato una maggiore massa muscolare e una maggiore forza di presa, nonostante una forza massima specifica inferiore. I gruppi trattati con DHT sottocutaneo hanno rivelato una maggiore massa cardiaca, che dimostra una prevalenza di effetti collaterali dell'uso di AAS principalmente nei topi femmine e maschi castrati. Sono necessarie ulteriori analisi per valutare se gli aspetti cellulari come CSA, mionuclei per fibra, cellule satellite e tipo di fibra presentano anche differenze tra i gruppi nel nostro studio.
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