Antibody-Based Delivery of Pro-Inflammatory Cytokines for the Therapy of Extracranial and Cranial Tumors
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ETH Library Antibody-Based Delivery of Pro- Inflammatory Cytokines for the Therapy of Extracranial and Cranial Tumors Doctoral Thesis Author(s): Puca, Emanuele Publication date: 2019 Permanent link: https://doi.org/10.3929/ethz-b-000388684 This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information, please consult the Terms of use.
Diss. ETH NO 26519
ANTIBODY-BASED DELIVERY OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINES FOR THE
THERAPY OF EXTRACRANIAL AND CRANIAL TUMORS
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
Presented by
EMANUELE PUCA
Master of Science in Medicinal Chemistry
(La Sapienza University of Rome)
Born 26.04.1992
Citizen of Rome, Italy
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Dario Neri, examiner
Prof. Dr. Cornelia Halin, co-examiner
2019
11 SUMMARY
In the last century, the pharmacological treatment of cancer patients has relied on the use of
chemotherapeutic agents that preferentially kill rapidly proliferating cells. Modern cancer
chemotherapy was pioneered by Sydney Farber, who ignited the dream of a universal cure of
cancer after that he accidentally discovered a powerful anti-neoplastic agent in a vitamin
analogue (i.e., anti-folate) for the treatment of the leukemia patients. Unfortunately, it was soon
realized that most low-molecular weight pharmaceuticals do not efficiently localize at the
tumor site, causing undesired toxicities that prevented the dose escalation to therapeutically
active regimens. The way to treat cancer patients was revolutionized by the advent of a new
branch of medicine called immuno-oncology (also named cancer immunotherapy). Its story
stretches back to the beginning of the XXth century and has required decades of research efforts
and billions of dollars of investment to build the foundation for today’s lifesaving treatments.
This revolution was prompted by a completely new way of thinking and managing cancer
patients. Rather than using pharmaceuticals to directly attack malignant cells, oncologists
started treating the patient’s own immune system, that would in turn track down and destroy
cancer.
Cytokines are small proteins present in our body that have the ability to modulate the activity
of the immune system. They are typically present in the blood at extremely low concentrations
(e.g., in the picomolar concentration range), but their production can be dramatically increased
in certain pathological conditions. The ability of cytokines to stimulate both pro- and anti-
inflammatory responses has been exploited by researchers in order to generate drugs for the
treatment of various type of malignancies. Some recombinant preparations of cytokine
products have gained marketing authorization (interleukin-2, tumor necrosis factor, interferon-
!). However, as for chemotherapeutic agents, cytokines may cause severe side-effects when
administered systemically. It is therefore conceivable that these products would benefit from
an increase of the therapeutic index. The fusion of cytokine to antibody moieties, capable of
selective localization at the site of disease, represents one possible strategy to reach
therapeutically active regimens while reducing systemic toxicities.
This thesis describes the generation of novel antibody-cytokine fusion proteins based on
interleukin-12 (IL12). The cytokine was sequentially fused to two different tumor targeting
5antibodies, L19 (L19-mIL12) and Sm3E (Sm3E-mIL12). L19 recognizes the extra-domain B
(EDB) of oncofetal fibronectin, which is specifically expressed on the tumor-associated
extracellular matrix. Sm3E targets the carcinoembryonic antigen, a cellular tumor-associated
antigen commonly used as a diagnostic and therapeutic tool for the treatment of patients with
colorectal cancer. Moreover, we studied treatment-related toxicities of two clinical grade
antibody-cytokine fusions (i.e., L19-TNF and L19-IL2) upon bolus and fractioned
administration modalities in immunocompetent tumor-bearing mice. The in vivo activity of
L19-mIL12, L19-mTNF and L19-IL2 was eventually explored in immunocompetent mice
bearing orthotopic glioblastomas.
The antibody-based delivery of interleukin-12 using the L19-mIL12 product mediated a potent
anti-tumor activity in immunocompetent BALB/c bearing CT26 carcinomas and WEHI-164
sarcomas, which could be improved by combination with checkpoint blockade. L19-mIL12
also inhibited tumor growth in C57BL/6 with Lewis lung carcinoma (LLC), but in this case
cancer cures could not be obtained, both in monotherapy and in combination. A microscopic
analysis and a depletion experiment of tumor-infiltrating leukocytes illustrated the contribution
of NK cells and CD8+ T cells for the anti-cancer activity observed in both tumor models. Upon
L19-mIL12 treatment, the density of regulatory T cells (Tregs) was strongly increased in LLC,
but not in CT26 tumors. A FACS analysis also revealed that the majority of CD8+ T cells in
CT26 tumors were specific to the retroviral AH1 antigen.
Antibody-cytokine fusions proteins (also termed immunocytokines) represent one important
class of pharmaceutical products. As previously mentioned, the homing of pro-inflammatory
cytokines at the tumor site often leads to an improvement of the therapeutic index. However,
toxicity profiles at equivalent doses are typically similar, since side-effects are mainly driven
by the cytokine concentration in blood. In order to explore avenues to harness the therapeutic
potential of immunocytokines while decreasing potential toxicity, we compared bolus and
fractionated administration modalities for L19-TNF and L19-IL2 in F9 teratocarcinoma and
C51 Colon carcinoma bearing mice. A biodistribution analysis revealed that a fractionated
administration of L19-IL2, but not of L19-mTNF, could deliver comparable product doses to
the tumor with decreased product concentration in blood, compared to bolus injection.
However, fractionated schedules allowed the safe administration of a cumulative dose of L19-
mTNF, which was 2.5-times higher than the lethal dose for bolus injection. Dose fractionation
led to a prolonged tumor growth inhibition for F9 teratocarcinomas, but not for C51 colorectal
6tumors, which responded best to bolus injection. Thus, dose fractionation may have different
outcomes for the same antibody-cytokine product in different biological contexts.
Glioblastoma multiform (GBM) is the deadliest primary brain tumor, with 241’000 deaths
worldwide each year. The standard treatment comprises maximal safe resection, followed by
radiation and temozolomide. In many cases these regimens offer a time-constricted benefit to
patients, after which the tumor recurs in a more aggressive form. The relentless ineffectiveness
of therapeutic strategies render glioblastoma one of the major unmet medical need. L19-mIL12,
and L19-mTNF and L19-IL2 were tested in two different immunocompetent mouse orthotopic
models of GBM, GL-261 and SMA-560 in collaboration with Prof. Michael Weller, Dr. Patrick
Roth and Tobias Weiss (USZ). The intravenous administration of targeted IL12 and TNF cured
a proportion of tumor-bearing mice, but L19-IL2 was not efficacious. L19-TNF induced a
selective hemorrhagic necrosis within the glioma mass, while L19-mIL12 promoted an
infiltration of CD8+ T cells and of NK cells. Cured mice in both treatment groups rejected a
subsequent challenge with glioma cells, indicating the onset of protective immunity. The
therapeutic effect was completely abolished in RAG-/- mice or in mice treated with the non-
targeted cytokines, evidencing the importance of both immune system and L19 tumor-targeting
properties for the anti-cancer activity.
Colorectal cancer is the third commonest tumor worldwide with 862 000 reported deaths in
2018. The carcinoembryonic antigen (CEACAM5, or simply CEA) is a heavily glycosylated
protein overexpressed in 90% of gastrointestinal tumors. CEA expression in healthy
individuals is confined to the apical surface of mature enterocytes, limiting its exposure to the
vascular system. In cancer patients, enterocytes lose polarization and start expressing CEA
around the whole surface. Moreover, the glycoprotein is actively cleaved from the cell surface
by phospholipases, resulting in increased serum concentrations of the antigen. The serum CEA
levels serve as a diagnostic and prognostic indicator in patients with colorectal cancer, where
elevated levels correlate with a reduced overall survival. The cell-bound antigen has served as
a target for tumor imaging and various cancer therapies. In this thesis, we used a stably
transfected murine colon carcinoma cell line (named C51-CEA) to study the in vivo anti-cancer
activity of Sm3E-mIL12 in immunocompetent BALB/c mice. The protein efficiently localized
at the tumor site and was able to cure 60% of the treated mice in monotherapy. A microscopic
analysis showed that the density of CD8+ T and NK cells increased upon treatment with Sm3E-
7mIL12, indicating a possible contribution of these immune cells in the anti-cancer activity
observed in the C51-CEA model.
In summary, we have developed and tested novel antibody-cytokine fusions for the treatment
of murine models of various type of cancer. The fully human homologues of these products
hold promises for the treatment of human conditions.
82 RIASSUNTO
Il trattamento farmacologico di pazienti oncologici si è basato, negli ultimi decenni,
sull’utilizzo di agenti chemioterapici capaci di interferire preferenzialmente con le cellule a
rapida proliferazione. La chemioterapia moderna è stata ideata da Sydney Farber, il quale ha
innescato il sogno di una cura universale contro il cancro, dopo aver accidentalmente scoperto
che una sostanza (i.e., piccola molecola organica) strutturalmente simile all’acido folico
presentava una potente attività antineoplastica. Sfortunatamente, però si è visto che tali
composti a basso peso molecolare non possiedono la facoltà di localizzarsi in modo selettivo
nel tumore, causando di conseguenza una tossicità indesiderata. Tale problema impedisce di
incrementare la dose di questi medicinali biologici a regimi farmacologicamente attivi. Il modo
di affrontare il cancro è stato rivoluzionato dall’avvento di una nuova branca farmaceutica
chiamata immuno-oncologia (anche chiamata immunoterapia oncologica). La storia
dell’immunoterapia inizia durante i primi anni del XXesimo secolo, ma solo dopo decenni di
ricerca ed investimenti di miliardi di dollari sono stati sviluppati medicinali efficaci. La
rivoluzione in questo campo è avvenuta grazie ad un modo nuovo di pianificare il trattamento
dei malati oncologici. Invece di utilizzare farmaci citotossici (i.e., tossici per le cellule a rapida
proliferazione), gli oncologi hanno iniziato a sfruttare l’avvento di proteine terapeutiche capaci
di stimolare il nostro sistema immunitario a combattere i tumori.
Le citochine sono piccole molecole proteiche che modulano l’attività del sistema immunitario.
Sono generalmente presenti nel sangue a basse concentrazioni (e.g., oscillano nel range
picomolare), ma la loro secrezione può vertiginosamente incrementare in determinate
situazioni patologiche. L’abilità delle citochine di stimolare risposte sia pro- che anti-
infiammatorie è stata sfruttata dai ricercatori per lo sviluppo di nuovi farmaci biologici. Alcune
citochine ricombinanti hanno ottenuto l’approvazione dalla FDA (interleuchina-2, fattore di
necrosi tumorale, interferone-!). Tuttavia l’amministrazione intravenosa di questi prodotti può
indurre gravi effetti collaterali come nel caso della chemioterapia tradizionale. È generalmente
accettata l’idea che questi prodotti beneficierebbero di un aumento del proprio indice
teraupetico. La fusione delle citochine con anticorpi monoclonali capaci di localizzarsi
selettivamente nelle masse neoplastiche rappresenta una possibile strategia per aumentare
l’efficacia delle citochine riducendo simultaneamente il rischio di provocare effetti collaterali.
In questa tesi viene descritto lo sviluppo di nuovi farmaci biologici basati sull’interleuchina-
12 murina (mIL12). La citochina ricombinante è stata fusa con due diversi anticorpi anti-
9tumorali, L19 (L19-mIL12) e Sm3E (Sm3E-mIL12). L’anticorpo L19 lega il dominio B della
fibronectina (EDB), selettivamente generato nelle matrici extracellulari associate ai tumori.
Sm3E è invece un’ immunoglobulina specifica per l’antigene carcino-embrionale (CEA)
espresso sulla superficie delle cellule maligne. Il CEA viene comunemente misurato per la
diagnosi e prognosi di pazienti con tumori gastrointestinali. Abbiamo inoltre studiato la
tossicità indotta dal trattamento di due proteine di fusione (i.e., L19-TNF e L19-IL2) dopo
somministrazione di una singola dose bolo o in seguito al frazionamento del bolo in tre diverse
somministrazioni. L’attività anti-tumorale in vivo di L19-mIL12, L19-mTNF, e L19-IL2 è stata
infine misurata in modelli murini di glioblastoma.
L19-mIL12 è un potente farmaco antitumorale come dimostrato da studi preclinici condotti nei
modelli CT26 carcinoma e WEHI-164 sarcoma, dove oltre il 50% dei topi sono stati curati dal
trattamento in monoterapia. L’efficacia del medicinale viene inoltre aumentata in regimi di
combinazione con inibitori del checkpoint immunitario. Nel modello Lewis Lung Carcinoma
(LLC) L19-mIL12 determina soltanto una parziale inibizione della crescita tumorale, sia in
monoterapia che in combinazione. Un’analisi microscopica insieme ad un esperimento di
deplezione dei leucociti ha dimostrato il ruolo cruciale delle cellule T CD8+ e delle cellule
natural killer (cellule NK) in entrambi i modelli sperimentali. In seguito al trattamento con
L19-mIL12, la densità intramuorale delle cellule T regolatorie (Tregs) è stata fortemente
incrementata nel LLC ma non nel CT26. Uno studio dei leucociti, nel modello CT26, ha infine
dimostrato come la maggior parte delle cellule CD8+ presenti nella massa neoplastica
riconoscano l’antigene retrovirale AH1.
Proteine di fusione anticorpo-citochina (anche definite come immunocitochine) rappresentano
una classe importante della branca farmaceutica. Come già menzionato, la facoltà
dell’anticorpo di veicolare la citochina proinfiammatoria al sito tumorale porta solitamente ad
un incremento dell’indice terapeutico. Considerando però dosi equivalenti di citochina, gli
effetti collaterali dei prodotti veicolati e non veicolati sono analoghi, in quanto la tossicità è
legata alla concentrazione della citochina nel sangue. Al fine di esplorare la potenzialità delle
immunocitochine, abbiamo paragonato la tollerabilità e l’efficacia in seguito a diverse modalità
di somministrazione di L19-TNF e L19-IL2, nei modelli F9 teratocarcinoma e C51 Colon
carcinoma. Uno studio di biodistribuzione ha dimostrato come la somministrazione frazionata
di L19-IL2, ma non L19-mTNF, permetta l’accumulo di una quantità simile di prodotto nel
tumore, paragonato all’iniezione di un unico bolo, mantenendo però livelli di farmaco inferiori
10nel tessuto sano. Il frazionamento della dose di L19-mTNF ha permesso di iniettare una
quantità 2.5 volte superiore rispetto alla singola dose letale (i.e., del bolo), senza comportare
nessuna particolare tossicità. Nel modello F9 questa strategia ha condotto ad una prolungata
inibizione della crescita tumorale, non osservabile con tumori C51 i quali hanno risposto
meglio alla somministrazione in bolo. Si può concludere che il frazionamento della dose
potrebbe dar luce ad esiti diversi sia a seconda dell’immunocitochina che dell’indicazione
oncologica.
Il glioblastoma multiforme (GBM) rappresenta il tumore cerebrale piu maligno, provocando
ogni anno 241’000 morti nel mondo. La terapia standard include chirurgia, seguita da
radioterapia, e chemioterapia (i.e., temozolomide). Purtroppo, nella quasi totalità dei casi questi
interventi portano solo ad un beneficio temporaneo della malattia, la quale si ripresenta in una
forma ancora più aggressiva. Al giorno d’oggi non sussiste una terapia curativa per il GBM, la
cui diagnosi rimane una delle piu infauste. Durante questo progetto di dottorato, abbiamo
testato l’attività L19-mIL12, L19-mTNF, e L19-IL2 in due modelli diversi di glioblastoma
ortotopici, chiamati GL-261 e SMA-560. Lo studio è stato svolto in collaborazione con il
gruppo del Prof. M. Weller dell’Università Ospedaliera di Zurigo (USZ). I prodotti basati
sull’IL12 e sul TNF, ma non L19-IL2, sono risultati efficaci nel contrastare la crescita di GBM
ortotopici. In uno studio meccanicistico abbiamo dimostrato come L19-TNF induca una
selettiva necrosi tumorale al centro della massa neoplastica, mentre L19-mIL12 promuova
l’infiltrazione di cellule T CD8+ e NK. Il rigetto di una successiva iniezione intracerebrale di
cellule maligne da parte dei topi curati dal trattamento, dimostra come le immunocitochine
abbiano la capacità di generare cellule di memorie specifiche contro questi tumori. Si è
osservato inoltre che l’effetto antitumorale viene completamente abrograto in topi senza cellule
B e T (i.e., topi RAG-/-) o in topi immunocompetenti ma trattati con le versioni non veicolate
dei tre prodotti (i.e., KSF-mIL12, KSF-mTNF, e KSF-IL2). È stato cosi evidenziato il
coinvolgimento cruciale di un sistema immunitario funzionale e l’importanza della
veicolazione selettiva delle citochine proinfiammatorie nel tumore al fine di ottenere l’effetto
terapeutico desiderato.
Il tumore al colon-retto è il terzo cancro piu’ comune al mondo. L’espressione dell’ antigene
carcino-embrionale (CEACAM5 o CEA), una glicoproteina sovraespressa in 90% dei tumori
gastrointestinali, è ristretta alla superficie apicale degli enterociti in pazienti sani. Nei pazienti
oncologici gli enterociti perdono la loro ordinaria polarizzazione ed iniziano ad esprimere CEA
11lungo tutta la propria superficie, rendendo l’antigene accessibile al sistema vascolare. Inoltre
CEA viene attivamente rilasciato come proteina solubile dalle fosfolipasi provocandone
l’aumento della concentrazione sanguigna. Al giorno d’oggi il misuramento dei livelli di CEA
nel sangue è un test comunemente eseguito a fini diagnostici e prognostici, dove alti livelli di
CEA correlano solitamente con una ridotta sopravvivenza. La forma integrale di membrana
dell’antigene è stata ampiamente sfruttata per scopi sia di imaging che terapeutici. In questa
tesi abbiamo utilizzato il modello di cellule tumorali murine C51 transfettate con l’antigene
CEA umano (C51-CEA), in modo da poter misurare l’attività di Sm3E-mIL12 in un sistema
murino immunocompetente. Come dimostrato in un esperimento di biodistribuzione la proteina
di fusione si è localizzata selettivamente nel tumore. Con una dose cumulativa di 180 µg Sm3E-
mIL12, il 60% dei topi trattati in monoterapia sono stati curati. Un’analisi microscopica dei
tumori ha rivelato un aumento della densità intratumorale di cellule T CD8+ e NK dopo il
trattamento con Sm3E-mIL12, suggerendo un possibile loro coinvolgimento nell’attività
antineoplastica osservata.
Per riassumere, abbiamo sviluppato e studiato nuove immunocitochine per il trattamento di
vari modelli tumorali murini. Lo sviluppo di immunocitochine umane ne potrà permettere
l’utilizzo clinico in campo oncologico.
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