Engineering Protease-Responsive Microbubbles for Ultrasound-Based Diagnostics

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Engineering Protease-Responsive
Microbubbles for Ultrasound-
Based Diagnostics

 Doctoral Thesis

 Author(s):
 Dubey, Dragana

 Publication date:
 2022

 Permanent link:
 https://doi.org/10.3929/ethz-b-000536880

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DISS. ETH NO. 28134

ENGINEERING PROTEASE-RESPONSIVE MICROBUBBLES FOR

         ULTRASOUND-BASED DIAGNOSTICS

                 A thesis submitted to attain the degree of

                  DOCTOR OF SCIENCES OF ETH ZURICH

                           (Dr. sc. ETH Zurich)

                               presented by

                      DRAGANA DUBEY-RISTANOVIC

                 MSc ETH Chemical and Bioengineering,

         Eidgenössische Technische Hochschule Zürich, Switzerland

                            born on 04.12.1993

                          citizen of Switzerland

                place of origin: Wangen-Brüttisellen (ZH)

                   accepted on the recommendation of:

                 Prof. Dr. Simone Schürle-Finke, examiner

                  Prof. Dr. Outi Supponen, co-examiner

                 Prof. Dr. Klazina Kooiman, co-examiner

                               Zurich, 2022

SUMMARY
      Tools for detecting the activity of proteolytic enzymes could potentially transform point-of-care di-

agnostic medicine. Proteases, also known as proteinases or peptidases, are enzymes that hydrolyze peptide

bonds in their target proteins or peptide sequences and play crucial roles in health and disease. Due to the

irreversibility of this cleavage reaction, proteolytic activity is tightly controlled within healthy organisms,

and dysregulation of these processes typically results in pathological states. Enabling visual readout and

quantification of proteolytic activity at a diseased site could inform clinicians about the progression of a

patient’s disease and help make therapeutic decisions. Strategies to design biosensors that detect local pro-

teolytic activity have primarily employed readouts based on fluorescent emission and are thus inherently

limited by the penetration depth of light in tissue. In contrast, ultrasound offers the possibility of deep

tissue imaging and is one of the most frequently used imaging technologies in medicine. Its main ad-

vantages are that it is broadly available, portable, free of radiation, and relatively inexpensive compared to

other imaging modalities such as computed tomography and magnetic resonance imaging.

      Ultrasound molecular imaging is enabled by employing contrast agents, typically microbubbles, that

consist of a gas core surrounded by a lipid shell. Due to their gas cores, they reflect ultrasound waves highly

efficiently, generating areas of increased contrast in ultrasound images. Thus far, ultrasound molecular

imaging has mostly focused on targeted binding of microbubbles to sites of interest, without changing

their physical properties. More recently, incorporating responsiveness into microbubbles by altering their

acoustic properties upon exposure to biological cues (e.g. aptamers and changes in pH), has been shown

as a promising approach for imaging of soluble molecular targets. A potential strategy to design responsive

microbubbles involves crosslinking the lipid shell to alter its mechanical properties, followed by decross-

linking upon exposure to a stimulus. However, synthetic microbubbles capable of sensing proteolytic ac-

tivity had not yet been demonstrated prior to the work presented in this thesis. A barrier to designing

microbubbles for this purpose appears to have been a lack of fundamental understanding of how cross-

linking and decrosslinking affect microbubble properties, knowledge that is essential for designing opti-

mally responsive UCAs.

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       This thesis studies the influence of crosslinkers on microbubbles, identifying crosslinker design con-

siderations for the development of responsive UCAs, and reports detection of proteolytic activity using

microbubbles via cleavage-based decrosslinking for the first time. The first part of this work focuses on a

systematic description of the effect of crosslinking on different microbubble properties including acoustic

attenuation, mechanical stability, and surface charge. For this purpose, poly(acrylic acid)-functionalized

microbubbles consisting of DSPC and DSPE-PAA were crosslinked with different concentrations of three

amine-terminated crosslinker with distinct branching structures (e.g. different number of arms) and mo-

lecular weights. To facilitate comparison between different crosslinker experiments, the crosslinker con-

centration was translated to “links per DSPE-PAA”, representing the theoretical number of chemical

bonds between the emulsifier lipid and crosslinker branches, assuming full conversion. It was expected

that crosslinking of the microbubble shell would restrict volumetric oscillations during ultrasound inson-

ification and, therefore, reduce nonlinear behavior. In contrast mode imaging, crosslinking of the mi-

crobubble shell with a short 2arm crosslinker resulted in 7-fold suppression of nonlinear signal, as hy-

pothesized. Moreover, it was shown that the transition of microbubble properties from the non-cross-

linked to the crosslinked state with increasing crosslinker concentration strongly depends on the cross-

linked network connectivity on the microbubble shell, which was supported with a computational model

based on graph theory. Highly branched crosslinkers achieved this transition of properties at lower con-

centrations and exhibited a step-like dependence in comparison to unbranched crosslinkers. In particular,

the 4 arm crosslinker resulted in a transition at a concentration of just 2 links per DSPE-PAA, while the

long 2 arm and short 2 arm crosslinkers reached saturation only at a concentration of 16 links per DSPE-

PAA.

       Next, a model system was developed by incorporating photocleavable units into the crosslinker de-

sign. Here, UV light served as a convenient model stimulus, allowing precise control over stimulus inten-

sity and exposure time. Considering the previously established structure-to-performance relationships,

two types of photocleavable crosslinkers, one with a linear, unbranched structure (2armPC) and one with

a branched structure (4armPC), were synthesized and incorporated onto microbubble shells. Reversibility

of the mechanical changes induced by crosslinking was validated by exposing crosslinked microbubbles

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to UV light. The kinetics of decrosslinking was observed by measuring the acoustic response of microbub-

bles at their harmonic frequency over 5 min. The rate of response was shown to depend on the density of

the crosslinked network as well as the intensity of the employed UV light. The findings revealed a trade-

off between sensitivity and kinetic resolution and were consistent with the observations for non-respon-

sive crosslinkers. Specifically, the fastest decrosslinking kinetics were observed for 2armPC crosslinked

microbubbles with 16 links per DSPE-PAA, while the highest sensitivity to the UV light intensity was

found for 64 links per DSPE-PAA of the 4armPC crosslinker.

      Finally, the system was adapted for the detection of proteolytic activity. For this purpose, two peptide

sequences tailored to chymotrypsin were selected and incorporated into the design of crosslinkers. Chy-

motrypsin was selected as a model protease due to its well-established specificity and cleavage motifs. The

first sequence was based on a natural substrate of chymotrypsin (Val-Gly-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-Val),

while the second was designed for improved specificity (Ala-Glu-Leu-Phe-Ser-Glu-Gly-Leu). In an initial

characterization step, cleavage sites and associated cleavage kinetics were characterized using LC-MS.

Based on the molecular weights of the fragments, two cleavage sites were found for the natural substrate

(between Phe and Tyr and Tyr and Glu), while the designed sequences only showed signs of a single cleav-

age site (between Phe and Ser). Based on pseudo-first order kinetic approximations, the catalytic efficiency

of the natural substrate was estimated and found to be 4.42 × 103 M-1 s-1 while that of the designed peptide

was slightly higher at 5.27 × 103 M-1 s-1. Both values are within the expected range for kinetic constants for

this reaction. For initial proof-of-concept experiments, proteinase K, a protease with broad specificity, was

used to verify the adaptability of the established framework to other types of stimuli. Peptide-crosslinked

microbubbles with a concentration of 16 links per DSPE-PAA of the natural substrate crosslinker showed

the highest acoustic response upon exposure to 50 nM proteinase K. Moreover, exposing these bubbles to

25 or 100 nM proteinase K resulted in proportional changes of the observed response rate. Overall, the

observations were consistent with the findings of UV-responsive microbubbles. Next, chymotrypsin was

used to test cleavage efficiency resulting from specific cleavage. Preliminary data upon exposure to 5 nM

chymotrypsin showed that the cleavage efficiency was comparable that of proteinase K, demonstrating the

feasibility of detecting proteases within the nanomolar range. The concepts presented in this thesis provide

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the fundamental framework for responsive crosslinker design considerations and can drive future ad-

vancements in ultrasound molecular imaging, particularly acoustic detection of microbubbles with tailor-

able responsiveness to proteolytic activity.

ZUSAMMENFASSUNG
     Diagnostische Systeme zum Nachweis der Aktivität proteolytischer Enzyme haben das Potenzial die

"Point-of-Care"-Diagnostik zu revolutionieren. Proteasen (auch Proteinasen oder Peptidasen genannt)

sind Enzyme, die Peptidbindungen ihrer Zielproteine oder Peptidsequenzen hydrolysieren und dabei eine

entscheidende Rolle in der Erhaltung eines gesunden Organismus spielen. Aufgrund der Irreversibilität

dieser Spaltungsreaktion wird die proteolytische Aktivität in unseren Körpern streng kontrolliert und eine

Fehlregulation dieser Prozesse führt typischerweise zu Erkrankungen. Die Visualisierung und Quantifi-

zierung der proteolytischen Aktivität an einer erkrankten Stelle könnte Ärzte über den Krankheitsverlauf

eines Patienten informieren und ihnen dabei helfen therapeutische Entscheidungen zu treffen. Existie-

rende Methoden zur Detektion von lokaler proteolytischer Aktivität, sogenannte «biologische Sensoren»,

basieren hauptsächlich auf Messungen einer Veränderung der Fluoreszenzemission gewisser Moleküle

und sind daher von Natur aus durch die Eindringtiefe von Licht in Gewebe begrenzt. Im Gegensatz dazu

ermöglicht Ultraschall Bildgebung tief im Gewebe und ist eine der meistverwendeten bildgebenden Tech-

nologien in der Medizin. Die Hauptvorteile einer Ultraschall-basierten Methode sind, dass die Instru-

mente weitläufig verfügbar, tragbar, strahlungsfrei und im Vergleich zu anderen bildgebenden Verfahren

wie Computertomographie und Magnetresonanztomographie relativ kostengünstig sind.

     Für die molekulare Ultraschallbildgebung werden Kontrastmittel verwendet, typischerweise Mikro-

bläschen, die aus einem Gaskern bestehen, der von einer Lipidhülle umgeben ist. Aufgrund ihres Gaskerns

reflektieren Mikrobläschen Ultraschallwellen hocheffizient und erzeugen so Bereiche mit erhöhtem Kon-

trast in Ultraschallbildern. Bisherige Methoden der molekularen Ultraschallbildgebung basieren haupt-

sächlich auf der gezielten Bindung von Kontrastmitteln an Rezeptoren, die von erkrankten Zellen expri-

miert werden. Dadurch wird das Signal auf die erkrankte Stelle konzentriert, die physikalischen Eigen-

schaften der Mikrobläschen bleiben dabei jedoch unverändert. Um biologische Signale akustisch detek-

tieren zu können, müssen die Mikrobläschen funktionalisiert werden, so dass sich ihre akustischen Eigen-

schaften wenn sie einem diesem Signal ausgesetzt sind, verändern. Eine mögliche Strategie zur Umsetzung

solcher reaktionsfähiger Mikrobläschen umfasst die Funktionalisierung der Lipidhülle mit labilen

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Molekülen («Crosslinker»). Durch die Bindung dieser Moleküle werden die Lipide auf der Bläschen-

Schale miteinander vernetzt, wobei die volumetrischen Oszillationen der Mikrobläschen im Ultraschall

teilweise unterdrückt werden. Dies führt zu einer Veränderung der mechanischen Eigenschaften der Hülle

und zum Verlust des harmonischen Signals in Ultraschallbildern. Durch die Interaktion der Mikrobläs-

chen mit dem biologischen Signal wird die labile Bindung gebrochen und es erfolgt eine Entwirrung des

Hüllen-Netzwerks, wodurch ein Teil der ursprünglichen akustischen Eigenschaften wiederhergestellt

wird. Synthetische Mikrobläschen, die in der Lage sind, proteolytische Aktivität zu erkennen, wurden vor

der hier beschriebenen Studien, jedoch noch nicht demonstriert. Grund dafür war das fehlende Verständ-

nis der relevanten Parameter und Prozesse, welche die akustischen Eigenschaften der Mikrobläschen be-

einflussen und wie man diese verändern kann, um Proteasen zu detektieren.

     Diese Dissertation untersucht den Einfluss von vernetzten Lipidhüllen auf Mikrobläschen, identifi-

ziert relevante Parameter für das Design der integrierten, labilen Moleküle und präsentiert den ersten

Nachweis proteolytischer Aktivität unter Verwendung von Mikrobläschen durch Aufspaltung des Netz-

werks auf der Blasenhülle. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf eine systematische Beschrei-

bung des Einflusses der Vernetzung auf verschiedene Mikroblaseneigenschaften, einschließlich akusti-

scher Signal-Dämpfung, mechanischer Stabilität und Oberflächenladung. Dazu wurden Poly(acrylsäure)-

funktionalisierte Mikrobläschen bestehend aus DSPC und DSPE-PAA mit unterschiedlichen Konzentra-

tionen von drei Amin-funktionalisierten Crosslinkern mit unterschiedlichen Verzweigungsstrukturen

(z.B. unterschiedlicher Arm-Anzahl) und Molekulargewichten vernetzt. Um den Vergleich zwischen ver-

schiedenen Experimenten zu erleichtern, wurde die Konzentration der Crosslinker in „Verbindungen pro

DSPE-PAA“ übersetzt, was die theoretische Anzahl chemischer Bindungen zwischen dem funktionalisier-

ten Lipid und den Crosslinker-Armen - unter Annahme einer vollständigen Umsetzung - darstellt. Es

wurde erwartet, dass die Vernetzung der Mikrobläschenhülle volumetrische Oszillationen während der

Beschallung begrenzt und somit das nichtlineare Verhalten (harmonische Antwort) reduziert. In der Kon-

trast-Bildgebung führte die Vernetzung der Mikrobläschenhülle mit einem kurzen zwei-armigen Cross-

linker wie vermutet zu einer 7-fachen Unterdrückung des nichtlinearen Signals. Darüber hinaus konnte

gezeigt werden, dass der Übergang der Mikrobläscheneigenschaften vom unvernetzten in den vernetzten

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Zustand mit zunehmender Crosslinker-Konzentration stark von der Netzwerkkonnektivität auf der Mik-

robläschenhülle abhängt. Durch ein rechengestütztes Model konnten diese Resultate untermauert werden.

Hochverzweigte Crosslinker erreichten diesen Eigenschaftsübergang bei niedrigeren Crosslinker-Kon-

zentrationen und zeigten im Vergleich zu linearen Crosslinkern eine stufenartige Abhängigkeit. Zum Bei-

spiel führte der 4-armige Crosslinker zu einem Übergang bei einer Konzentration von nur 2 Verbindun-

gen pro DSPE-PAA, während ein kurzer 2-armiger und ein langer 2-armiger Crosslinker erst bei einer

Konzentration von 16 Verbindungen pro DSPE-PAA diese Sättigung erreichten.

     Als nächstes wurde ein Modellsystem entwickelt, indem photolabile Einheiten in das Crosslinker-

Design integriert wurden. Hierbei diente UV-Licht als praktisches Modell-Signal (anstelle eines biologi-

schen Signals), das eine präzise Kontrolle über die Intensität und die Expositionszeit ermöglicht. Unter

Berücksichtigung der zuvor etablierten Abhängigkeit der Eigenschaftsübergänge von der Crosslinker-

Struktur wurden zwei Arten von photolabilen Crosslinkern synthetisiert und in Mikrobläschenhüllen ein-

gebaut. Der erste Crosslinker hatte eine lineare Struktur (2armPC) und der zweite hatte eine verzweigte

Struktur (4armPC). Die Reversibilität, der durch die Vernetzung induzierten, mechanischen Veränderun-

gen wurde validiert, indem vernetzte Mikrobläschen UV-Licht ausgesetzt wurden. Die Kinetik der Cross-

linker-Spaltung konnte beobachtet werden, indem die akustische Reaktion von Mikrobläschen bei ihrer

harmonischen Frequenz über 5 min gemessen wurde. Es wurde gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit

von der Dichte des vernetzten Netzwerks sowie der Intensität des verwendeten UV-Lichts abhängt. Die

Ergebnisse zeigten einen Kompromiss zwischen Sensitivität und kinetischer Auflösung und stimmten mit

den Beobachtungen für nicht-labile Crosslinker überein. Die schnellste Spaltungskinetik wurde für

2armPC-vernetzte Mikrobläschen mit 16 Verbindungen pro DSPE-PAA beobachtet, während die höchste

Sensitivität gegenüber der UV-Lichtintensität für 64 Verbindungen pro DSPE-PAA des 4armPC-Cross-

linkers beobachtet wurde.

     Schließlich wurde das System für den Nachweis proteolytischer Aktivität angepasst. Dazu wurden

zwei Peptitsequenzen die bevorzugt durch Chymotrypsin gespalten werden ausgewählt und in das Design

von Crosslinkern eingebaut. Chymotrypsin wurde aufgrund seiner gut etablierten Spezifität und seiner

Spaltungsmotive als Modell-Protease gewählt. Die erste Sequenz basierte auf einem natürlichen Substrat

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von Chymotrypsin (Val-Gly-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-Val), während die zweite auf höhere Spezifität ausge-

legt war (Ala-Glu-Leu-Phe-Ser-Glu-Gly-Leu). In einem ersten Charakterisierungsschritt wurden Schnitt-

stellen und zugehörige Spaltungs-Kinetik mittels Flüssigchromatographie mit Massenspektroskopie-

Kopplung charakterisiert. Basierend auf den Molekulargewichten der Fragmente wurden für das natürli-

che Substrat zwei mögliche Spaltungsstellen gefunden (zwischen Phe und Tyr und Tyr und Glu), während

die Designer- Sequenz nur Anzeichen einer einzigen Spaltungsstelle (zwischen Phe und Ser) zeigte. Basie-

rend auf kinetischen Näherungen pseudo-erster Ordnung wurde die katalytische Effizienz des natürlichen

Substrats auf 4.42 × 103 M-1 s-1 geschätzt, während die des Designer-Peptids mit 5.27 × 103 M-1 s-1 etwas hö-

her lag. Beide Werte liegen im erwarteten Bereich der kinetischen Konstanten für diese Reaktion. Für erste

"Proof-of-Concept"-Experimente wurde Proteinase K, eine Protease mit breiter Spezifität, verwendet.

Peptid-vernetzte Mikrobläschen mit einer Konzentration von 16 Verknüpfungen pro DSPE-PAA des na-

türlichen Substrat-Crosslinkers zeigten die höchste akustische Reaktion bei Einwirkung von 50 nM Pro-

teinase K. Darüber hinaus führte die Zugabe von 25 oder 100 nM Proteinase K zu proportionalen Verän-

derungen der beobachteten Reaktionskinetik. Insgesamt stimmten die Beobachtungen mit den Ergebnis-

sen von UV-responsiven Mikrobläschen überein. Als nächstes wurde Chymotrypsin verwendet um die

aus der spezifischen Spaltung resultierende Spaltungseffizienz zu testen. Vorläufige Daten nach Einwir-

kung von 5 nM Chymotrypsin zeigten, dass die Spaltungseffizienz mit der von Proteinase K vergleichbar

war und damit die Detektion von Proteasen im nanomolaren Bereich belegt. Die in dieser Dissertation

vorgestellten Konzepte bilden ein Fundament für Überlegungen zum Design von reaktionsfähigen Cross-

linkern und können zukünftige Entwicklungen in der molekularen Ultraschallbildgebung vorantreiben,

insbesondere die akustische Detektion von proteolytischer Aktivität mittels vernetzter Mikrobläschen.

CONTRIBUTIONS
     This thesis was supervised by Prof. Dr. Simone Schürle-Finke, who also conceptualized the topic of

this thesis. Design of methodologies to alter microbubble shell properties as well as experimental work

including synthesis, characterization and evaluation of microbubbles and their responsiveness was carried

out by Dragana Dubey-Ristanovic. Dr. Matej Vizovisek contributed to microbubble synthesis and some

of the experiments presented in Chapter 3, 4 and 5. Dr. Michael Christiansen contributed to the design of

the acoustic characterization system, pressurized optical density setup and the miniaturized cassette pre-

sented in Chapter 2 and 5, respectively. Manuel Weber, Vincent Castonguay-Siu, Olena Berkovska, Alex-

ander Müller, Miro Giobbi and Naomi Frommenwiler contributed to preliminary experimental work that

was the base of some of the experiments presented in Chapter 3 and Appendix A, B and D. Samuel

Gebhardt performed some of the initial characterization of the attenuation measurement setup in Appen-

dix E and contributed to experiments presented in the supplementary information of Chapter 3 and 4.

Jasmin Feike contributed to system characterizations presented in Chapter 2 and contributed to some of

the experiments shown in the supplementary information of Chapter 4 and 5. MALDI-TOF analysis of

photocleavable crosslinkers was carried out by MoBiAS MS services. Marco Cattaneo and Prof. Dr. Outi

Supponen helped with the acoustic pressure measurements presented in Chapter 2. All contributions were

essential to understanding the principles of microbubble shell crosslinking and for the analysis of their

acoustic response upon exposure the stimuli, herein investigated.